The Level of Neurogranin in Plasma Exosomes of Patients with Vascular Cognitive Impairment

YU Chunlei; SUN Wenqiang; TAN Lin; LIU Ping; LI Zihao; ZHAO Weina

doi:10.3969/j.issn.2096-5516.2021.01.007

Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders >

2021 , Vol. 4 >Issue 1: 42 - 45

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.2096-5516.2021.01.007

Original article

The Level of Neurogranin in Plasma Exosomes of Patients with Vascular Cognitive Impairment

YU Chunlei ^,¹ ,
SUN Wenqiang ² ,
TAN Lin ² ,
LIU Ping ² ,
LI Zihao ² ,
ZHAO Weina ^,³^,⁴

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1 Department of Neurology, the Fourth People’s Hospital of Kunming City, Kunming, Yunnan 650300, China
2 Mudanjiang Medical College
3 Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College, Mudanjiang, Heilongjiang 157011, China
4 Heilongjiang Provincial Key Laboratory for prevention and treatment of ischemic stroke, Mudanjiang, Heilongjiang 157011, China

Received date: 2020-12-09

Revised date: 2021-01-05

Online published: 2021-03-25

Fold

Abstract

Objective:

To investigate the expression and significance of neurogranin (NG) in plasma exosomes of patients with vascular cognitive impairment (VCI).

Methods:

Sixty patients with VCI were selected as the observation group, and 40 patients with cerebrovascular disease (CVD) were selected as the observation group. Patients without cognitive impairment were served as CVD group and 30 healthy volunteers as control group. Exosomes were extracted from plasma exosomes kit and verified by electron microscopy and particle size analysis. Ng levels in exosomes were detected by ELISA, and cognitive function (MoCA) score was measured. Mann Whitney U test, t test and Pearson correlation analysis were used for comparison between groups.

Results:

The total MOCA score and scores of attention, language, execution, memory, calculation, orientation and visual structure skills in the observation group were significantly lower than those in the CVD group and the healthy control group (P < 0) The levels of ng in the plasma exosomes of VCI patients, CVD patients and normal controls were (609.89±201.12), (898.28±146.23) and (905.39±130.15) mg/L, respectively. There were significant differences between VCI group and the other two groups (P < 0.05). Conclusion: the level of ng in plasma exosomes of patients with VCI is decreased, which may be a potential diagnostic marker of VCI.

Key words： Vascular Cognitive Impairment; Plasma Exosomes; Neurogranin

Cite this article

YU Chunlei , SUN Wenqiang , TAN Lin , LIU Ping , LI Zihao , ZHAO Weina . The Level of Neurogranin in Plasma Exosomes of Patients with Vascular Cognitive Impairment[J]. Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders, 2021 , 4(1) : 42 -45 . DOI: 10.3969/j.issn.2096-5516.2021.01.007

血管性认知障碍(vascular cognitive impairment，VCI)是指脑血管病危险因素（如高血压病、糖尿病和高脂血症等）、明显（如脑梗死和脑出血）或不明显的脑血管病（如白质疏松和慢性脑缺血）引起的、从轻度认知障碍到痴呆的一大类综合征，涵盖了血管源性认知损害从轻到重的整个发病过程^[1]。随着人口老龄化，痴呆的发病率越来越高，据统计，在中国年龄在60岁及以上的24949万人中，估计有1507万人患有痴呆，其中392万人患有血管性痴呆，就诊及治疗率均偏低，但此类患者约半数会在五年内进展为痴呆^[2]，对社会经济造成了极大的影响，其中VCI已经成为痴呆的第二大常见原因，仅次于阿尔茨海默病^[3]。研究发现脑脊液中神经颗粒素（Neurogranin，NG）在VCI患者中显著升高，并且与VCI患者tau蛋白之间存在相关性，可预测认知下降和神经变性疾病^[4]。但近来发现血浆外泌体中NG在血管性痴呆患者中有所升高^[5]，若能明确血浆外泌体中NG在VCI患者中的改变，为VCI早期检查和治疗提供新的标记物，为早期诊疗奠定基础。本研究拟探讨NG在VCI患者中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 基础资料

经牡丹江医学院附属红旗医院伦理委员会批准，收治2018年1月-2019年12月VCI患者60例为观察组（VCI组），脑血管病（cerebrovascular disease，CVD）无认知障碍组（CVD组）40例，另选取健康志愿者30例为正常对照组。VCI组男26例，女34例;年龄53~75岁，平均（63.90±8.33）岁;平均受教育年限（9.80±2.74）年。CVD组男21例，女19例;年龄55~70岁，平均（61.27±5.56）;平均受教育年限（10.40±1.69）年;正常对照组男15例，女15例，年龄54~68岁，平均（60.67±5.86）岁;平均受教育年限（10.50±1.52）年。并对三组高血压、糖尿病、高血脂、吸烟、饮酒情况进行比较，三组基础资料差异无统计学意义(P>0.05)。观察组纳入标准：（1）观察组符合《血管性认知障碍诊治指南》VCI 诊断标准^[6]，（2）经CT、MRI 检查发现左侧半球皮质下梗死;（3）蒙特利尔认知量表（MoCA）评分<26分，如果患者受教育年限≤12年则在测试结果上加上1 分;（4）患者既往无痴呆病史;（5）患者病情稳定。排除标准：（1）由于其他因素导致的认知功能障碍（阿尔茨海默病、帕金森病等）;（2）精神疾病;（3）颅内肿瘤;（4）严重的听、说、视力障碍;（5）癫痫患者。

1.2 神经心理学评估

采用蒙特利尔认知评估量表( MoCA) 评价两组认知功能，包括注意( 3分) 、语言( 5分) 、执行( 3分) 、记忆( 6分) 、视结构技能( 4分) 、计算力( 3分) 和地点定向力( 6分) ，评分0~30分，分值越高，患者认知功能越良好。

1.3 血浆外泌体提取及神经颗粒素检测

1.3.1 血浆的分离

清晨6-8点空腹采血，用抗凝管（含EDTA）采集10 mL静脉血，4℃条件下，2500r离心10 min，取上清液即为血浆，冻存于-80℃，以上过程在2 h内完成。

1.3.2 血浆外泌体的提取

采用ExoQuick试剂盒法提取血浆外泌体，将血浆样品转移至离心管中，于4℃以3000r离心10min，去除样品中的细胞碎片。去除细胞碎片的上清液转移至新离心管，于4℃以10000r离心20min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新离心管中。在0.5mL去除杂质的离心上清液中加入2.5mLBIS试剂，使用涡旋振荡器震荡离心管1min使溶液充分混合，再放置2℃-8℃ 2h。取出装有混合液的离心管于4℃以10000r离心60min，弃去上清液。取50μL 1×PBS缓冲液均匀吹打离心沉淀物，待其均匀分布在PBS中，然后转移到新的1.5mL离心管中。将离心管于4℃以12000r离心2min，留取上清液冻存于-80℃冰箱。

1.3.3 外泌体透射电镜

从-80℃冰箱取出冻存的血浆外泌体，解冻后用1×PBS溶液适当稀释。使用移液器吸取10μL稀释后的外泌体滴至200目铜网上，室温下处理20min。1×PBS溶液50 μL固定1min，重复两次。用4%戊二醛固定20分钟，滤纸吸干并用1×PBS洗涤，置于室温下晾干，于透射电镜下观察，80KV电压下成像。

1.3.4 外泌体粒径分析

经过Exoquick试剂盒提取得到的外泌体取50μL加950μL 1xPBS进行1∶20稀释，使用0.22μm 滤膜过滤外泌体稀释液。过滤后的外泌体悬液直接使用纳米粒度颗粒跟踪分析仪（NanoSight NS 300）进行粒径检测，使用软件NTA3.2Dev Build 3.2.16进行分析。NanoSight NS 300配备sCMOS相机进行拍摄，激光类型为Blue488，快门317，增益15。每个样本重复3次。

1.3.5 NG检测

通过上述步骤提取及验证血浆外泌体后，每个样本取等体积血浆通过ELISA方法检测NG水平。

1.4 统计学方法

应用SPSS（Version25.0）软件进行相关统计学分析，两组间比较采用Mann-Whitney U检验、t检验分析。

2 结果

2.1 组间认知功能评分

VCI组 MoCA 总评分及执行、命名、注意、语言、抽象、延迟回忆及定向评分均显著低于正常对照组，差异有统计学意义(P< 0.05)（表1）。

表1 VCI组和正常对照组MoCA评分比较(x±s，分)

Tab.1 Comparison of MoCA scores between VCI and normal control (x±s)

组别	n	视空间与执行能力	命名	注意	语言	抽象	延迟回忆	定向	总评分
VCI组	60	3.01±1.28	2.45±0.54	4.67±1.28	1.68±0.65	0.89±0.76	1.52±1.78	5.34±1.37	20.34±3.55
正常对照组	30	5.00±0.00	3.00±0.00	5.23±0.37	3.00±0.00	2.00±0.00	3.76±0.38	6.00±0.00	28.00±0.82
t 值		-7.735	-4.350	-3.307	-11.489	-7.727	-6.537	-2.268	-10.854
P 值		0. 000	0. 000	0. 020	0. 000	0. 000	0. 000	0. 026	0. 000

VCI组MoCA总评分及执行、命名、注意、语言、抽象、延迟回忆及定向评分均显著低于CVD组，差异有统计学意义(P<0.05)（表2）。

表2 VCI组和CVD组MoCA评分比较(x±s，分)

Tab.2 Comparison of MoCA scores between VCI and CVD (x±s)

组别	n	视空间与执行能力	命名	注意	语言	抽象	延迟回忆	定向	总评分
VCI组	60	3.01±1.28	2.45±0.54	4.67±1.28	1.68±0.65	0.89±0.76	1.52±1.78	5.34±1.37	20.34±3.55
CVD组	40	5.00±0.00	2.97±0.18	5.33±0.47	3.00±0.00	2.00±0.00	3.73±0.44	6.00±0.00	28.03±0.80
t值		-7.735	-3.898	-3.280	-11.489	-7.727	-6.677	-2.268	-11.016
P值		0. 000	0. 000	0. 020	0. 000	0. 000	0. 000	0. 026	0. 000

2.2 组间血浆外泌体中NG浓度比较

等体积血浆中外泌体NG水平，VCI组的血浆外泌体中的NG水平明显低于正常对照组（表3）

表3 VCI组和正常对照组血浆外泌体中NG浓度比较(x±s，mg/L)

Tab. 3 Comparison of NG concentrations in plasma exosomes between VCI and normal control (x±s, mg/L)

组别	n	NG
VCI组	60	609.89±201.12
正常对照组	30	905.39±130.15
P值		0.000

等体积血浆中外泌体NG水平，VCI组的血浆外泌体中的NG水平明显低于CVD组（表4）

表4 VCI组和CVD组血浆外泌体中NG浓度比较(x±s，mg/L)

Tab. 4 Comparison of NG concentrations in plasma exosomes between VCI and CVD (x±s, mg/L)

组别	n	NG
VCI组	60	609.89±201.12
CVD组	40	898.28±146.23
P值		0.000

3 讨论

VCI是一种进展型认知损害的疾病，是由于血管病引起的一类获得性认知损伤疾病。NG是一种分布于树突的突触后蛋白，主要由新皮层和海马的兴奋性神经元分泌，参与调节突触可塑性（如长时程增强效应和长时程压抑），因而在记忆巩固等方面发挥重要作用^[3]。NG是主要分布在海马、前额皮层、纹状体及杏仁核等与认知相关的脑功能区。既往针对NG的研究大多数在脑脊液，脑脊液的研究中显示，VCI基线期脑脊液神经颗粒素含量高，提示着皮层葡萄糖代谢和海马体积的进行性下降^[7]。但是由于脑脊液检查有创性，在临床开展困难，发展其在血液中的检测十分重要。在人血浆中NG是以多种内源性多肽形式存在的，脑脊液及血浆中的NG表达肽并不相同，有研究发现血管性痴呆患者脑脊液NG水平较正常对照组升高，血浆NG水平较正常对照无明显变化^[8]，但近来发现血浆外泌体中NG在血管性痴呆患者中有所降低^[9]。产生这种差异的原因可能是先前的研究主要集中在脑脊液，对于血浆NG的研究较少，纳入的样本量不足，导致没有明显的差异，另外NG的表达水平随着年龄而发生变化，入组患者标准不同也会导致结果的差异性。由于VCI患者血管内皮细胞受损，会导致血脑屏障发生改变，这是否会导致血浆中NG水平发生变化，还有待进一步研究。这些差异还可能受一些不同因素的影响，如pH或存储稳定性，脑脊液中NG在-20℃可稳定存在，而储存在-80℃的血浆中的活性酶，能够切割全长NG以产生新的肽的表型^[8]。我们的研究是通过对血浆外泌体中的NG检测明确NG的水平，显示VCI患者的NG水平明显低于CVD组，基本可以排除脑血管病对NG的影响。同时VCI患者的NG水平明显低于正常对照组，这与既往研究发现血浆外泌体中NG在血管性痴呆患者中有所降低，并且在血管性痴呆数年前就可以出现下降的结果相一致^[5]。因此，是否可以通过血液中检测NG的水平早期发现血管性认知障碍，从而进一步为VCI早期诊断和指标提供新靶点。

References

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