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Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders

Abbreviation (ISO4): Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders      Editor in chief: Jun WANG

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Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders >

2020 , Vol. 3 >Issue 4: 258 - 266

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.2096-5516.2020.04.001

Phosphorylation of Thr231 slightly differentiates structure and interactions of cis- and trans-tau226-236 peptide hexamers

  • MENG Qingqing , 1 ,
  • ZENG Xincheng 1 ,
  • SU Yuhong 1 ,
  • BAI Ganggang 1 ,
  • Nussinov Ruth 2, 3 ,
  • MA Buyong , 2
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  • 1 Leidos Biomedical Research, Inc., Frederick National Laboratory for Cancer Research, National Cancer Institute at Frederick, Frederick, MD 21702, USA
  • 2 Basic Science Program, Leidos Biomedical Research, Inc., Frederick National Laboratory for Cancer Research, National Cancer Institute at Frederick, Frederick, MD 21702, USA
  • 3 Sackler Inst. of Molecular Medicine Department of Human Genetics and Molecular Medicine Sackler School of Medicine, Tel Aviv University, Tel Aviv 69978, Israel

Received date: 2020-08-09

  Revised date: 2020-09-03

  Online published: 2020-12-25

Fold

Abstract

Objective: Investigate the effects of pT231 on the structure and peptide interaction in cis- and trans- tau oligomers, to examine their possible toxic mechanisms in Alzheimer's disease. Methods: Using replica-exchange molecular dynamics simulations, we studied the cis- and trans- hexamers of Tau225-246 fragment. The 56 replicas were simulated using NAMD program and CHARMM36 force field with GB model, from 300K to 450 K. Each replica was simulated for 200 ns, with total 11200 ns simulation time. Results: Interestingly, the backbone hydrogen bonds involving T231P232 had higher frequencies, indicated that they were the local interaction hot spots even before T231 phosphorylation. The backbone hydrogen bonds were more populous in trans- than in cis- tau hexamer. The 226VAVVR231T fragment had about 4%~10% β structure, more in trans- than in cis-hexamer. Although that the peptide N- to C- terminal distances were longer in trans-tau peptide, the cis- and trans-tau hexamers had similar solvent-accessible-surface areas and radius of gyrations. The Thr231phosphorylation abolished most backbone hydrogen bonds and β structures in cis-tau hexamer, but had less effects on trans-tau hexamer. The phosphate group formed salt bridge mostly with Arg230 in both cis- and trans-hexamer. However, phosphate preferd to form hydrogen bond with amide hydrogen of Arg230 in cis-hexamer, while in trans-hexamer the phosphate binds more to amide hydrogen of Lys234. The most decisive effects of T231 phosphorylation could be the exposed hydrophobic surface areaof VAVV, which increased about 100 Å2 after phosphorylation in cis-hexamer. But these areas were similar for trans-hexamer before and after T231 phosphorylation. Conclusion: Thr231 phosphorylation has different effects on the structure and chemical interaction in cis- and trans- Tau226-236hexamer. But there is no clear-cut difference that can link the local structure change to the toxicity of the tau oligomer. The differentiate effects of phosphorylation on the hydrophobic surface area of VAVV in cis- and trans- tau hexamer and the longer end-to-end distance of trans-tau226-236peptide need to be examined further in full length tau monomer and oligomers.

Key words： Alzheimer's disease; Tau protein; Amyloidosis; Phosphorylation; Molecular dynamics simulation

Cite this article

MENG Qingqing , ZENG Xincheng , SU Yuhong , BAI Ganggang , Nussinov Ruth , MA Buyong . Phosphorylation of Thr231 slightly differentiates structure and interactions of cis- and trans-tau226-236 peptide hexamers[J]. Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders, 2020 , 3(4) : 258 -266 . DOI: 10.3969/j.issn.2096-5516.2020.04.001

阿尔茨海默病的特点是细胞外β淀粉样蛋白（Aβ）的老年斑和细胞内Tau蛋白的神经原纤维共存。在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）中,过度磷酸化的Tau蛋白淀粉样蛋白以双股螺旋纤维（paired helical filaments, PHF）的形式存在于细胞内的神经纤维缠结中[1⇓-3]。Tau蛋白含有352~441个氨基酸[4],对调节微管的稳定性和动态变化,以及轴突生长和轴突运输起着重要作用[5-6]。然而在AD患者中tau蛋白的过度磷酸化破坏了微管的稳定性,并且形成神经纤维缠结[7]。在过去的3年中,冷冻电镜在解析高分辨的生理和病理条件下的Tau蛋白核心纤维结构方面都取得了成功的突破。在AD[8],皮克氏病,慢性创伤性脑病和皮质基底节变性四种不同的疾病中,冷冻电镜下观察到的Tau蛋白纤维结构具有不同的构象[9⇓⇓-12]。这个现象表明了在不同的疾病状态下Tau蛋白在人脑中存在着不同的折叠方式,Tau蛋白纤维结构不光取决于Tau蛋白重复链段的序列[13],也取决于不同的疾病状态下的微环境。人全长Tau蛋白（441个氨基酸）纤维被认为是由覆盖着毛绒状的N-和C-末端的密集核心（由平行并排的β折叠股组成）,类似双层带电聚合物的刷状结构[14-15]。用多尺度的分子动力学模拟研究了该毛绒状涂层如何稳定Tau蛋白纤维,发现密集核心是Tau蛋白的微管作用域组成的纤维结构,部分N-和C-末端非均匀地聚集在硬核外周,最外围的刷状结构是N-端起始氨基酸链段组成[16]（图1）。
图1 Tau蛋白226-236片段在全长tau蛋白纤维中所处的结构位置以及磷酸化Thr231和反式Pro232的构象示意
磷酸化对tau蛋白富含脯氨酸结构域的影响主要是静电作用[17-18]。Lyons等人模拟了htau225-250肽段不同位置的磷酸化（pThr231和/或pSer235）诱导的构象变化。在这两种磷酸化模式中都发现了磷酸化会破坏tau蛋白的末端β折叠结构（226VAVVR230和244QTAPVP249）。在实验离子强度下,pThr231/pSer235双磷酸化模式的模拟结果与NMR结构表征最为一致,均观察到一个瞬时α-螺旋（239AKSRLQT245）。研究发现pThr231/pSer235和Arg242间形成了盐桥[17]。另一项研究用动力学模拟了磷酸化诱导的富含脯氨酸结构域的Tau蛋白片段（Tau225-246）的构象变化,虽然比第一项研究的Tau蛋白片段少了4个氨基酸残基但也提供了类似的结果[18]。该研究采用了两种不同的磷酸化模式：Thr231-Ser235的磷酸化和Thr231-Ser235-Ser237-Ser23的磷酸化。磷酸化导 致其与相邻赖氨酸和精氨酸残基接触形成盐桥,从而破坏了在Tau蛋白225-246中观察到的天然β 折叠结构。他们也观察到了当Tau蛋白225-246 在四个位点被磷酸化时,会形成一个短暂的α-螺旋（238SAKSRLQ244）[18]。
上面讨论的磷酸化位点Thr231与脯氨酸残基Pro232相连接。Thr231可以被多种脯氨酸介导的激酶磷酸化。由于脯氨酸以脯氨酰键可定义反式或顺式构象（图1）,Thr231磷酸化和Pro232异构化的耦合导致在tau蛋白病中独特的反式tau和顺式tau现象。依据pThr231的相对构象,反式tau和顺式tau可能具有不同的功能。一些研究发现,顺式pThr231- tau具有高度神经毒性,在多种神经退行性疾病中作为tau蛋白病的早期驱动者。在双相情感障碍患者和健康人大脑样本的检查也发现了在患者脑内有顺式p-tau[19]。然而,最近的研究发现,tau肽的反式异构体更易于聚集[20]。可溶性tau蛋白寡聚体可能才是导致AD的原因[21⇓⇓⇓-25]。为了研究Thr231磷酸化对于顺-反式tau异构体构象以及寡聚体的影响,本课题组使用副本交换分子动力学模拟研究了tau蛋白226-235片段六聚体,结果发现顺式和反式异构体具有相似的二级结构和分子内相互作用。但是反式异构体具有更长的肽延伸长度。同以前单体多肽的模拟结果类似,我们也发现磷酸化破坏了在Tau蛋白225-246中观察到的天然β折叠结构,其影响顺式大于反式tau。

1 资料与方法

多肽六聚体起始结构：反式tau226-235多肽六聚体的初始排列取自于分子动力学模拟平衡后的全长tau蛋白纤维结构[16]（图1）,存为pdb格式文件。使用Chimera程序[26]调入反式tau六聚体结构,将Pro232从反式构象手动转化为顺式构象;使用CharmmGui网站（www.CharmmGui.org）对顺反六聚体结构各自进一步处理：（1）所有tau 226-235多肽的N端和C端用ACE（乙酰基）和CT3（甲胺基）分别中和,（2）添加磷酸化Thr231的磷酸根结构用以模拟磷酸化Thr231的影响。下载顺反六聚体以及磷酸化顺反六聚体的psf拓扑文件和pdb原子坐标文件用以分子动力学模拟。
分子动力学模拟：全原子分子动力学模拟采用NAMD2.13（NAnoscale Molecular Dynamics） 软件包[27]和CHARMM36（Chemistry at Harvard Macromolecular Mechanics）分子力场[28]。NAMD用于在大规模并行计算机上快速模拟生物大分子体系的并行分子动力学软件,通过数值求解运动方程计算蛋白质分子中原子轨迹。CHARMM力场按原子类型拟合多肽和氨基酸中的化学键和非键作用的势函数和力场参数,从而可以利用分子力学和分子动力学计算蛋白质分子的能量和应力。本工作采用隐式溶剂化GBIS模型,参数如下：离子浓度为0.1 mol,溶剂介电常数为78.5, alpha截断为14,表面张力为0.006, switchdist 为15Å,截断设置为16Å。在运行副本交换分子动力学模拟（REMD）之前,用NAMD对tau多肽六聚体进行了5000步的初步结构优化。在REMD模拟中,使用了温度分布从300 K°到450 K°的56个模拟副本。时间步长为1 fs。每1000步长做一次交换。每个模拟副本的模拟时间为200 ns,总模拟时间为11200 ns。平均交换率为0.8。
模拟结果分析：首先用NAMD2自带程序sortreplicas把56个副本中的轨迹按温度重新编排分成不同温度的轨迹。利用VMD分析六聚体中多肽分子的二级结构,氢键,和溶剂可接触的表面积。氢键定义为氢原子与氧或氮原子的距离小于3.0Å,原子键角度大于30°。溶剂可接触的表面积计算时水分子的球半径为1.4Å。

2 结果与讨论

2.1 磷酸化Thr231侧链基团在顺式和反式Tau蛋白多肽中的盐桥和氢键作用

图2展示了顺式tau蛋白和磷酸化后顺式tau蛋白的两个模拟副本的温度变化,表明模拟副本很好地覆盖了此区间内大部分的温度范围,能为副本交换模拟提供良好的构象搜寻。表1列举Tau226-236六聚体磷酸化Thr231侧链基团和其他主链/侧链的氢键在最低三个副本（T1: 300-304.46 K°）温度区间的累计频率（%）。Tau蛋白多肽片段226VAVVRTPPKSP236有两个带正电的氨基酸Arg230和Lys234。由于N端和C端的氨基酸基团已经封闭成中性,Tau226-236多肽六聚体带有12个正电,Thr231磷酸化后的Tau226-236六聚体带有6个正电。在整体正电的环境下,负电的磷酸化Thr231侧链基团与周围氨基酸的主链和侧链都形成稳固的氢键和盐桥键（表1,图3）。在与侧链形成氢键和盐桥键时,顺反式基本保持相同的氨基酸作用频率（表1）,都是Arg230主导且远超过Lys234。即使以Argline有5个氢键位点而Lysine只有3个NH,顺式中Arg230的平均频率（1015.6/5=203）大于Lys234（209/3=70）;反式中也是如此（Arg230平均996/5=199, Lys234平均391/3=130）。
图2 第54号副本在顺式tau蛋白和磷酸化后顺式tau蛋白六聚体模拟中的温度变化表明本工作中副本交换动力学模拟有充分的构象温度变化空间
表1 Tau226-236六聚体磷酸化Thr231侧链基团和其他主链/侧链的氢键累计频率(%)
pCis-tau pTrans-tau
Donor Acceptor 累计频率 Donor Acceptor 累计频率
THR231-Main THR231-Side 124.6 THR231-Main THR231-Side 124.2
ARG230-Main THR231-Side 46.6 LYS234-Main THR231-Side 69.9
ALA227-Main THR231-Side 43.6 SER235-Main THR231-Side 55.2
SER235-Main THR231-Side 38.9 ALA227-Main THR231-Side 52.0
VAL228-Main THR231-Side 22.1 ARG230-Main THR231-Side 29.1
VAL229-Main THR231-Side 17.5 VAL226-Main THR231-Side 28.1
VAL226-Main THR231-Side 16.6 VAL228-Main THR231-Side 10.9
LYS234-Main THR231-Side 12.9 VAL229-Main THR231-Side 5.4
ARG230-Side THR231-Side 1015.6 ARG230-Side THR231-Side 996.8
LYS234-Side THR231-Side 209.0 LYS234-Side THR231-Side 391.8
SER235-Side THR231-Side 78.9 SER235-Side THR231-Side 89.2
THR231-Side THR231-Side 6.1 THR231-Side THR231-Side 11.8

Note: T1: 300-304.46 K.˚

图3 磷酸化Thr231基团与侧链和主链NH形成盐桥和氢键（绿色直线）
与主链形成氢键时,除了3个脯氨酸没有NH外,磷酸化Thr231基团与其他所有氨基酸的肽链NH都有可能结合（表1）。不管顺式或反式,磷酸化Thr231基团都是最偏向于Thr231的NH结合,其中大部分是与本身Thr231的NH形成氢键（图3A）。与其他氨基酸NH形成氢键的排序顺式或反式略有不同,除邻近的Arg230外,顺式tau的磷酸根易和Ala227/ Ser235的NH形成氢键,而反式tau的磷酸根多与Lys234的NH结合,然后也是Ala227/Ser235随后。所以顺式和反式tau中磷酸根结合方式的最大区别在于顺式中Arg230/Lys234的NH与磷酸根氢键频率比是46.6/12.9,而反式的比例为29.1/69.9。
磷酸化Thr231基团易与Ser235主链NH形成氢键是磷酸化Thr231基团与Ser235侧链氢键的附带结果,而易与Ala227主链NH形成氢键促使我们进一步检测其氢键结构细节。结果发现Ala227主链NH与磷酸根形成氢键时往往伴随着Val226的主链NH也与磷酸根形成氢键;在顺式tau中Ala227/Val226的氢键比是43.6/16.6;而在反式中Ala227/Val226的氢键比是52.2/28.1。总的来说,反式tau多肽中磷酸化Thr231基团更易与肽链NH形成氢键。

2.2 磷酸化对顺式和反式Tau蛋白多肽六聚体主链相互作用和二级结构的影响

副本交换动力学模拟中56个模拟副本分布在300-450 K的温度区间。本研究比较了3个低温温度区间（每个区间3个副本）内T231磷酸化的影响（T1: 300-304.46 K; T2: 313.57-318.23 K,和T3: 327.75-333.62 K）。表2列举Tau226-236六聚体多肽主链间氢键在3个温度区间的频率。在没磷酸化时Thr231- Pro232就是顺式和反式Tau226-236六聚体的相互作用中心,尽管顺式和反式tau多肽六聚体中肽链间有着不同的主链相互作用并且反式比顺式tau多肽间更易形成主链间氢键。反式tau多肽间前五个频率最高的氢键是THR231-ARG230,THR231-VAL229, SER235- PRO232, ARG230-ALA227, ARG230-VAL229;所有以上这些也都是顺式tau多肽中五个频率较高的氢键。由于Pro232Pro233Arg234Ser235易于形成发夹结构使同一多肽分子内的SER235-PRO232氢键增多导致顺式tau中SER235-PRO232氢键总数的高频率。高频率的Thr231-Thr231氢键表明顺式tau中存在平行对位的β层叠。如图4所示,本研究观测到226VAVVRT231部分在顺式tau多肽六聚体中形成了平行对位的β层叠;而在反式tau多肽六聚体中226VAVVRT231部分也有平行的β层叠,但是氨基酸顺序错开了一位。所以反式tau多肽六聚体中Thr231- Thr231氢键稀少,更多的是错开了一位的THR231- ARG230和ARG230- VAL229之间的氢键（表2）。总的来说,226VAVVRT231这部分有相对高的几率保持β二级结构（图5）。随着温度的增高,大部分主链氢键频率减少（表2）,符合一般蛋白质氨基酸构象随温度增高变化加大从而减少主链氢键的一般规律。但是在顺式tau多肽有两对氢键（ARG230-VAL226和THR231-ALA227）以及反式tau中三对氢键（ARG230-VAL229, ARG230-VAL228,和THR231- VAL226）出现了随温度增高而加强的现象。与之对应的β二级结构在顺式tau多肽中稍微浮动,而在反式tau中大幅提高（图5）。这种β二级结构随温度增高而加强的现象是tau蛋白聚集的特点,本课题组以前在副本交换模拟和实验研究K18的聚集时也发现类似现象[29]。值得注意的是226VAVVRT231这一链段正是链接全长tau蛋白无序的N-端和tau蛋白聚集的主要区域（对应K18）的关键部位。
表2 Tau226-236六聚体多肽主链间氢键在3个温度区间的频率(%)和T231磷酸化的影响
氢键 Cis-tau pCis-tau
Donor Acceptor T1 T2 T3 T1 T2 T3
SER235 PRO232 25.6 24.2 23.6 11.7 12.4 12.3
THR231 THR231 24.3 23.2 17.7 0.2 0.1 0.1
ARG230 VAL229 12.3 11.3 10.1 2.2 2.6 2.4
ARG230 ALA227 11.3 9.8 7.0 3.4 2.6 2.0
ARG230 SER235 10.7 7.9 5.6 3.2 2.8 2.9
ARG230 VAL226 10.4 11.3 10.1 5.3 6.8 8.2
VAL229 THR231 9.8 9.0 8.8 0.2 0.3 0.6
VAL228 VAL229 9.7 8.3 7.1 1.1 1.0 1.4
VAL229 PRO233 8.7 7.8 6.1 2.4 2.9 2.6
ARG230 THR231 8.6 9.7 9.3 2.0 2.4 2.2
VAL229 VAL228 8.5 6.5 5.9 2.1 2.2 2.2
THR231 VAL228 8.1 8.1 7.2 2.2 2.7 3.1
ARG230 PRO233 8.0 6.3 6.3 5.0 4.7 3.6
VAL226 VAL228 7.9 5.9 3.0 2.4 3.1 2.1
THR231 ALA227 7.8 9.8 10.0 0.3 0.4 0.5
氢键 Trans-tau pTrans-tau
THR231 ARG230 23.0 20.3 15.5 0.0 0.2 0.4
THR231 VAL229 22.1 12.8 7.2 0.2 0.2 0.1
SER235 PRO232 21.9 18.0 14.8 7.5 8.7 8.4
ARG230 ALA227 17.8 15.0 12.7 9.2 9.7 10.0
ARG230 VAL229 15.7 17.3 16.2 0.9 1.0 0.9
VAL226 THR231 15.0 10.3 6.2 2.6 2.7 2.1
ALA227 PRO233 14.3 9.8 5.0 2.5 2.9 2.6
ALA227 VAL228 14.2 10.1 6.3 3.2 3.7 4.5
ARG230 ARG230 11.9 9.8 7.7 13.4 8.9 6.2
THR231 ALA227 10.5 9.5 9.5 0.0 0.0 0.0
THR231 PRO233 9.3 6.9 4.6 2.1 1.3 0.9
VAL229 VAL226 8.7 6.2 4.0 9.2 7.3 4.9
ARG230 VAL228 8.6 11.8 14.1 16.8 16.4 13.6
VAL229 ARG230 8.1 7.2 5.5 1.1 1.1 0.7
THR231 VAL226 7.6 8.4 7.6 1.8 1.4 0.6

Note: T1: 300-304.46 K°; T2: 313.57-318.23 K°; T3: 327.75-333.62 K.

图4 未磷酸化的顺式和反式tau六聚体中观测到的平行β片层(黄色)
图5 磷酸化对顺式和反式tau六聚体中β结构的影响

2.3 磷酸化对顺式和反式Tau蛋白多肽六聚体的结构和形态的影响

Thr231磷酸化大幅减少了tau蛋白多肽六聚体主链间氢键频率和β二级结构（表2~3,图5）。从表2可见,无论顺式或反式,涉及Thr231主链的氢键在Thr231磷酸化后基本消失。总体来说Thr231磷酸化对顺式的影响要比反式更大,顺式tau主链氢键基本消失,而反式tau蛋白Thr231磷酸化后ARG230-ALA227还能保证10%左右的频率;同时ARG230-ARG230,VAL229-VAL226, ARG230-VAL228三对氢键的频率在Thr231磷酸化后还有所增加。从图5也能看出,Thr231磷酸化后顺式tau蛋白中226VAVVRT231中的β二级结构都在2%以下;而在反式tau蛋白中226VAVVRT231中VVR3个氨基酸在Thr231磷酸化后还能保持4%~6%的β结构。
表3列举了tau蛋白多肽六聚体中总共的二级结构百分比,溶剂可接触的表面积（SASA）和回转半径（rg）。VAVV4个疏水基团的溶剂可接触的表面积列在总面积后的括号里。六聚体中总共的二级结构中无序的coil和turn占了绝大部分,少量的α螺旋和集中在226VAVVRT231的β二级结构。α螺旋在磷酸化后荡然无存,β结构在反式tau蛋白多肽六聚体中略有遗存。尽管顺式和反式tau蛋白多肽单体的构象完全不同,顺式和反式六聚体的总表面积和回转半径都很相似,且不太受Thr231磷酸化的影响。但是如果考察VAVV四个疏水基团的表面积,会发现Thr231磷酸化对顺式和反式tau蛋白多肽六聚体的对疏水基团的表面积的不同影响。Thr231磷酸化使顺式tau蛋白多肽六聚体的VAVV疏水基团更为暴露在寡聚体表面,而对反式tau蛋白多肽六聚体VAVV疏水基团表面积基本没有影响。这种区别可能是对应于Thr231磷酸化对顺式和反式六聚体的氢键和β二级结构的不同影响。
表3 Thr231磷酸化对Tau226-236多肽六聚体的结构和形态的影响
alpha beta coil turn SASA(Å2)① Rg(Å)
顺式 1.1 2.8 37.4 58.6 4742 (3190) 11.5
顺式磷酸 0.2 1 41 58 4806 (3455) 11.6
反式 2.6 2.4 50.3 44.7 4780 (3262) 11.4
反式磷酸 0.2 1.8 62.4 35.6 4767 (3273) 11.6

Note：①SASA Total area and hydrophobic surface area of VAVV（parenthese）

Tau226-236多肽只是tau蛋白中的一个小片段。为探讨Thr231磷酸化对tau蛋白整体的可能影响,我们统计tau蛋白多肽六聚体中Tau226-236多肽的N-端和C端Cα的末端距。从图6可见反式tau蛋白多肽比顺式更为伸展有较长的末端距,Thr231磷酸化只使顺式和反式tau蛋白多肽的末端距略微增加。Tau蛋白纤维结构包括3层,最内核的纤维区和紧接着的包裹内核的软区以及最外层的电刷区。Tau226-236多肽处于连接内核和包裹的软区。这种顺式和反式tau蛋白多肽的末端距的明显区别表明顺式和反式磷酸化tau蛋白将有不同的柔软包裹层和不同的硬核包裹效应。顺式和反式磷酸化对tau蛋白毒性的影响可能通过整体tau蛋白寡聚体呈现,而不是局限于多肽片段的二级结构或聚集速率的影响。这些需要研究全长tau蛋白中Thr231磷酸化对顺式和反式tau蛋白的不同影响。
图6 顺反式Tau226-236多肽的末端距分布和磷酸化的影响。反式多肽末端距明显长于顺式tau磷酸化使顺反式Tau226-236多肽的末端距均有微弱的增长
一般来说β结构易于促进蛋白聚集,那么一个很自然的问题是Thr231磷酸化破坏Tau蛋白天然β折叠结构应该对应于Thr231磷酸化不易于引起tau的聚集从而减少其毒性。磷酸化tau蛋白毒性的一个显著特征是类似朊病毒一样的传播,这在顺式磷酸化tau蛋白中最为明显[30⇓-32]。所以磷酸化tau蛋白毒性是由两部分组成：起始聚集的速度和类朊病毒样传播的速度。Tau蛋白起始聚集的速度更取决于微管作用域重复链段的聚集特性,特别是PHF6*: 275VQIINK280和PHF6: 306VQIVYK311。本研究的结果表明顺式磷酸化tau蛋白226-235片段的β结构基本消失,顺式的也不高,所以tau蛋白226-235片段自身导致起始聚集速度的变化和可能性不高,除非VAVV疏水基团表面积变化能于PHF6*和PHF6的聚集高度关联。Tau蛋白类朊病毒样传播的速度取决于聚集成核区（比如PHF6*和PHF6）的表面暴露大小。因此推测顺式磷酸化tau蛋白226-235片段的链段伸展和疏水基团表面积可能使Tau蛋白的其他聚集成核区更容易暴露。当然这些需要对全长tau蛋白进行进一步的表征。

3 结论

通过对顺反式Tau226-236六聚体中Thr231磷酸化的影响比较,发现Thr231磷酸化对顺式和反式Tau226-236六聚体结构有不同的影响,但是缺乏十分清晰的局部结构区别。Thr231磷酸化完全破坏了顺式tau中主链间的氢键和β结构,但对反式Tau226-236六聚体影响较小。最大的区别可能是Thr231磷酸化促使顺式Tau226-236六聚体中VAVV部分有较大的疏水暴露面积,而这一作用在反式Tau226-236六聚体中较小。结合顺反式Tau226-236末端距的明显差别的特征,Thr231磷酸化如何造成顺反式Tau生物毒性的差别需要在全长Tau蛋白单体和寡聚体中进一步研究。

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