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Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders

Abbreviation (ISO4): Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders      Editor in chief: Jun WANG

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Etiology and diagnostic biomarkers of Alzheimer's disease

  • SONG Nan , 1 ,
  • LU Rui , 2 ,
  • WANG Junfeng , 3
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  • 1 The Academy of Military Medical Sciences, Institute of Military Cognition and Brain Sciences
  • 2 Department of Molecular & Cellular Physiology, Stanford University, California, USA
  • 3 Department of Research and Development, Biogen, Massachusetts, USA

Received date: 2019-03-18

  Revised date: 2019-04-08

  Online published: 2019-06-25

Abstract

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder resulted from complex interactions between genetic and environmental factors. Although there is no effective treatment so far, clinical trials suggest that early patients may be more likely to respond to treatment. Therefore, continuous research on pathogenic mechanism of AD and the AD diagnostic criteria, which has been revised in recent years, are increasingly emphasizing the use of biomarkers to achieve early diagnosis and intervention of AD. We now review the main pathogenic mechanisms and the advance s of AD biomarkers.

Cite this article

SONG Nan , LU Rui , WANG Junfeng . Etiology and diagnostic biomarkers of Alzheimer's disease[J]. Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders, 2019 , 2(2) : 379 -385 . DOI: 10.3969/j.issn.2096-5516.2019.02.013

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD),即老年痴呆病,是老年人群中引起痴呆的最常见的神经变性疾病[1]。根据2018年阿尔茨海默病国际(ADI)年度报告,2018年全球共有5 000万AD患者[2]。据估计,到2050年全世界将有1.52亿AD患者,这主要是由于预期寿命延长和人口老龄化造成的。更严峻的是,2015年有58%的AD患者分布在低收入和中等收入国家,到2050年这一比例将上升到68%。中国是世界上老年人口最多的国家,人口老龄化的趋势日益明显。2012年底我国60周岁以上老年人口有1.94亿,2020年达到2.43亿,2025年将突破3亿。中国60岁以上人群的AD患病率为6.61%[3]。由于到目前为止AD患者没有有效的治疗方法,AD会给整个世界带来巨大的挑战。仅仅在2015年,AD导致的经济损失为818亿美元,到2030年可能高达2万亿美元。虽然已有的AD药物临床试验基本都以失败告终,但是这些试验结果表明早期的AD患者对于治疗更容易产生反应。因此,了解AD主要致病机制以及使用生物标志物实现AD的早期诊断将成为AD治疗和预防的关键。

1 AD的临床表现及病理特征

1.1 AD的临床表现

AD起病隐匿,临床表现主要是渐进性的认知功能和日常生活能力下降。根据病情的严重程度可以分成三个阶段。第一阶段(1~3年)为轻度痴呆期。表现为记忆减退,特别是对最近发生的事情容易遗忘;判断能力下降,难以进行分析、思考、判断和处理复杂的问题;仍能从事熟悉的日常工作或家务,但是漫不经心,不能独立进行购物、完成经济事务等,社交困难;对新事物表现茫然,情感淡漠,偶尔激惹,常有多疑;出现时间定向障碍,对所处的场所和人物能做出定向,对所处地理位置定向困难,复杂结构的视空间能力差;言语词汇少,命名困难。第二阶段(2~10年)为中度痴呆期,表现为远期和近期记忆严重受损,简单结构的视空间能力下降,时间、地点定向障碍;在处理问题、辨别事物的相似点和差异点方面有严重损害;不能独立进行室外活动,在穿衣和个人卫生等方面需要帮助;不能计算;出现各种神经症状,可见失语、失用和失认;情感由淡漠变为急躁不安,常走动不停,可见尿失禁。第三阶段(8~12年)为重度痴呆期。患者已经完全依赖别人照顾,记忆力丧失严重,仅存片段的记忆;日常生活不能自理,大小便失禁,呈现缄默、肢体僵直,查体可见锥体束征阳性,有强握、摸索和吸吮等原始反射。患者可能出现昏迷,最终一般死于感染等并发症。

1.2 AD的病理特征

AD患者脑部的病理变化包括神经元外的淀粉样蛋白斑块、神经元内的神经原纤维缠结和大量神经元损失[4]。淀粉样蛋白斑块主要由β淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)组成。Aβ具有40-42个氨基酸,是淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)先后被β-和γ-分泌酶(Secretase)切割后释放的多肽。而神经原纤维缠结的核心成分是过度磷酸化的Tau蛋白。AD脑的这两个标志性病理特征分别产生关于AD致病机制的Aβ假说和Tau假说。Aβ假说认为,大脑中Aβ的过度积累具有神经毒性,会损伤突触、神经元和认知功能,从而导致AD[5]。Tau假说则认为Tau蛋白异常是AD发生的原因[6]。在正常情况下,Tau蛋白结合并稳定微管,维持神经元轴突的稳定性。在AD患者脑部,Tau蛋白被过度磷酸化并且其与微管结合的能力受到损害。过度磷酸化的Tau逐渐在神经元中累积以形成神经原纤维缠结并引起轴突变性。但这两个假设并不相互排斥[7]。研究表明,在小鼠AD模型中,Aβ可以诱导Tau的过度磷酸化,而Tau不能诱导Aβ产生[8-9]。敲除Tau后Aβ的神经毒性大大减弱,这表明Tau介导了Aβ的神经毒性作用[10-11]。此外,Aβ斑块可以促进Tau聚集[12]。因此Aβ和Tau可以相互作用共同促进AD的发生发展[8]

2 Aβ在AD发生发展中的作用

Aβ是包含40~42个氨基酸的肽段,由APP经过β和γ分泌酶的依次切割而产生。APP有两种切割方式,即淀粉样(Amyloidiosis)和非淀粉样方式(Non-amyloidiosis)。前一种切割方式中,APP首先被β分泌酶切成两个片段,即淀粉样前体β分泌片段(Soluble amyloid precursor protein β, sAPPβ)和β切割的C端片段(β-C terminal fragment,β-CTF, C99)。β-CTF进一步被γ分泌酶切割,释放出包含39~43个氨基酸的Aβ片段和APP胞内域(APP intracellular domain, AICD)。Aβ主要被释放到胞外,聚集成寡聚体(Oligomer)和纤丝体(Fibril)。寡聚体被认为是最具毒性的Aβ形式,纤丝体则是老年斑的主要成分。后一种切割方式中,APP首先被α分泌酶在Aβ序列的第16位氨基酸后切割成淀粉样前体α分泌片段(Soluble amyloid precursor protein α,sAPPα)和α切割的C端片段(α-C terminal fragment,α-CTF, C83)。α-CTF进一步被γ分泌酶切割成p3和AICD。由于α分泌酶的切割一方面阻止了Aβ的形成,另一方面能产生神经营养的(Neurotrophic)sAPPα,所以一般认为APP的非淀粉样切割是保护性的[13]
Aβ假说在AD的致病机制中占主导地位。该假说认为,遗传或者环境因素可导致Aβ的产生过度或清除减少,引起Aβ的稳态失衡而逐渐积累。过度积累的Aβ会发生聚集,形成寡聚体和纤丝体。其中寡聚体形式的Aβ毒性最强,可攻击突触和神经元,导致神经突起的损伤和突触功能的异常;并引起神经元内离子浓度失衡,细胞产生氧化应激;另外打破蛋白激酶和磷酸酶的平衡,导致Tau蛋白过度磷酸化,产生神经纤维原缠结。最后,Aβ会引起突触和神经元的死亡,神经环路的破坏,最终导致痴呆[13]。目前Aβ假说得到很多证据支持。比如在AD小鼠模型中抑制Aβ的过度产生或者增加其清除都能改善AD症状[14-15]。另外在AD患者大脑中发现了β分泌酶活性的增加[16]。而21三体综合征(Trisomy 21,又称唐氏综合征,Down syndrome)的患者由于包含了APP基因的多一份拷贝,出现老年斑以及类似AD的痴呆症状。此外,AD的遗传因子也为Aβ假说提供了较强的证据支持。AD的遗传因子主要包括与家族性遗传AD(Familial AD, FAD)相关的基因突变,以及与散发型AD(Sporadic AD, SAD)相关的危险因子(Risk factor)。其中早发型AD患者一般都是家族性遗传的,携带常染色体显性基因突变(Autosomal dominant mutation)。目前已经报道的家族性遗传AD相关的基因有三个,分别是位于21号染色体的APP基因、位于14号染色体的PS1基因以及位于1号染色体的PS2基因。
APP是编码Aβ的前体蛋白。APP基因至少包括18个外显子,在mRNA剪接(Splicing)过程中可产生多种成熟体,最终翻译成365~770 aa的6种蛋白异构体(Isoform)。APP分布广泛,基本上全身表达,但只有APP695、APP751和APP770三种形式能产生Aβ[17]。目前在APP上发现大约25个与AD相关的突变。其中一些点突变,如K670N/M671L的Swedish突变可以促进β分泌酶切割APP;另一些点突变,如I716V的Florida突变或V717I的London突变,可促进γ分泌酶切割产生更多Aβ42;还有一些突变,如E693G的Arctic突变,可促进Aβ聚集,产生更具毒性的寡聚体[18]。最近发现A673T的突变可保护携带者抵抗AD甚至是正常衰老引起的认知功能下降。该突变可抑制APP被β分泌酶的切割,减少Aβ产生[19]。这些证据表明,APP的突变很可能通过影响Aβ的产生和聚集从而引起AD或者抵抗AD的。
此外,PS1和PS2编码了γ分泌酶中行使切割功能的主要成分。已发现与AD相关的160多个突变位于PS1上,10多个突变位于PS2上(www.molgen.ua. ac.be/ADMutations),这两个基因的突变占家族性遗传AD病例的大部分。但是,关于PS突变导致AD的机制尚有争议[20]。其中,PS1是首先被发现的γ分泌酶必要分子[21]。PS1敲除后,细胞产生的Aβ大大减少,APP被α或β分泌酶的切割不受影响,而α或β分泌酶切割产生的CTF大量积累。这说明PS1的缺失影响了γ分泌酶的切割。后来在PS1上发现两个天冬氨酸(Asp257和Asp385)[22],分别位于第6和第7跨膜区。任意一个天冬氨酸被突变成丙氨酸(Alanine)后,细胞不再产生Aβ,同时出现CTF的积累,说明PS1本身可能是天冬氨酸蛋白酶,行使切割APP的功能。重组表达的PS1(PS1dE9,不需要内切成成熟形式)重构在脂质体(Liposome)中,即有γ分泌酶活性[23]。同样,PS2上相应位点天冬氨酸(Asp263和Asp366)的突变,也可抑制其产生Aβ的功能。并且在PS1敲除的基础上进一步敲除PS2,能完全抑制Aβ形成。这说明PS2也可作为γ分泌酶的核心组分,参与了Aβ生成[24-25]
在散发型AD患者中,ApoE的多态性(Polymorphism)是与散发型AD关联性最好的遗传因子。ApoE含有299个氨基酸,具有多态性,包含三种形式,即ApoE2(Cys112, Cys158)、ApoE3(Cys112, Arg158)和ApoE4(Arg112, Arg158)[26]。ApoE2、3、4的出现频率在整体人群和AD人群不一样,其中ApoE4比例在AD人群显著提高,说明ApoE4可能利于AD发病。关于ApoE4引起AD患病概率增加的原因尚不清楚。已发现ApoE可能与Aβ清除相关,ApoE4清除Aβ能力不如ApoE2和ApoE3[27]。另外,ApoE还可能与Aβ结合,影响Aβ的聚集和毒性。
综上所述,APP、PS1和PS2基因的突变可导致家族性AD的发生,ApoE4则是散发型AD的危险因子。Aβ假说能较好地将上述突变和多态性统一起来,而上述突变和多态性也是Aβ假说的有力证据。

3 以Aβ为靶点的临床治疗

目前AD治疗主要通过药物作用于不同的神经递质系统,增强中枢神经系统的高级活动,缓解疾病症状。常用的药物有乙酰胆碱酯酶抑制剂和谷氨酸受体拮抗剂2大类。但是,针对AD的治疗要想获得显著和持久的疗效必须从AD病因下手,即以脑内Aβ为治疗靶点,这样的疾病改善疗法(Disease-modifying therapy)[28]主要有以下几种策略:(1)免疫治疗[29]:分为主动免疫和被动免疫,通过清除脑组织中已经存在的Αβ集聚来从根本上改善AD的临床症状。Αβ主动免疫治疗即把来自Αβ的多肽片段当作疫苗进行注射。临床试验显示,Αβ疫苗可以清除患者脑部的Αβ,但是不能显著改善患者的认知功能,而且有部分患者出现了脑脊髓膜炎等不良反应[30]。被动免疫指直接将针对Αβ的单克隆抗体通过静脉注射到患者体内。礼来公司solanezumab单抗在一项针对轻度患者的Ⅲ期临床试验中,发现对轻度AD患者无效[31]。而百健公司aducanumab在一项针对轻度患者的I期临床试验中显示了非常显著的疗效[32]。(2)分泌酶抑制剂[33]:抑制β分泌酶或γ分泌酶以阻止Αβ产生。但是γ分泌酶抑制剂的临床试验连续遭遇失败,礼来公司Semagacestat[34]、百时美施贵宝avagacestat[35]和米利亚德基因公司Tarenflurbil[36]在Ⅱ/Ⅲ期临床试验中均未能体现疗效。而多项β分泌酶抑制剂Ⅲ期临床试验尚在进行之中,结果未知,参与的被试药物有默沙东公司的verubecestat[37],阿斯利康和礼来公司共同开发的AZD3293[38]和强生公司的JNJ-54861911。
尽管AD药物研发经历了重重挫折,但是已有的临床试验结果给了人们一个重要的提示[39]:药物对于早期的轻度AD患者更容易产生疗效。这可能是因为重度患者的大脑神经元已经大量死亡,这时候无论是什么治疗都已经无力回天。因此,最近开展的临床试验都只针对轻-中度患者,特别是轻度患者开展,以期望提高临床试验的成功率。一旦有药物在轻度AD患者中效果明显,那么AD的早期诊断就是一个急需解决的问题。然而目前很难在大范围人群实现AD患者的早期诊断,这将使大量的早期患者错过最佳的治疗时机。早期诊断困难,一方面是因为患者和家属可能对AD存在认识误区。比如岁数大了得老年痴呆是正常的,担心得老年痴呆会被人笑话而不去看医生,看了医生也治不好等。另一方面,目前AD的诊断主要依靠医生问诊和神经心理学测试,主观性较强,医生的临床经验和神经心理学测试是否规范会对诊断的准确性造成影响。因此AD早期诊断迫切需要有客观,准确和效费比高的生物标记物。

4 AD早期诊断的生物标志物

生物标志物是指可被客观测量的指标,反映细胞、器官和整个身体的结构或功能的变化。生物标志物通常用于疾病诊断,风险评估和药物反应预测。目前,AD诊断生物标志物包括脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)生物标志物、脑成像和血液生物标志物。

4.1 AD的脑脊液生物标志物

CSF Aβ42和CSF Tau是研究最多且重复性最好的AD生物标志物,大量研究证实AD患者的CSF Aβ42水平低于认知正常的对照人群,而AD患者中CSF总Tau和磷酸化Tau则升高[9]。当CSF Aβ42或CSF Tau用于诊断AD时,ROC曲线的AUC约为0.8。把CSF Aβ42和CSF Tau这两项指标结合在一起可以进一步提高诊断准确性:CSF Tau /Aβ42比值用于诊断AD时,AUC可以超过0.9[9]。此外,CSF Aβ42和CSF Tau在AD患者临床症状发作前5~15年就开始发生异常变化了。在认知正常的老年人群中,约30%的个体有CSF Aβ42降低[10,11,40]。这些个体在未来10年中发生AD的概率明显高于CSF Aβ42水平正常的患者。因此,CSF Aβ42和CSF Tau可用作AD的诊断生物标志物。
由于CSF与脑组织直接接触,CSF的AD生物标志物总体上具有较高的诊断准确性。然而,CSF的AD生物标志物有明显的局限性。首先,CSF只能通过创伤性的腰椎穿刺获得,不可能用于筛查大量人群中的早期AD患者。其次,CSF生物标志物测试的操作程序仍有待标准化,以便建立统一的临界值来解释测试结果[41]。已有的研究指出使用不同的商业化ELISA试剂盒进行CSF Aβ42定量时结果差别很大[42]。即使使用同一公司来源的ELISA试剂盒,不同的实验室、仪器和操作人员似乎会产生系统偏差[43]

4.2 AD的脑成像生物标志物

脑部Aβ成像可以直接反映Aβ斑块在脑中的沉积,目前有三种Aβ脑成像的PET分子探针已被美国FDA批准用于临床实践,它们分别是来自GE的Vizamyl、来自Eli Lilly的amyvid和来自Piramal的neuraceq. Vizamyl或18F-flutemetamol衍生自PiB. PiB是同位素标记的硫黄素T衍生物,它特异性结合大脑中的Aβ斑块并通过PET-CT进行检测。PiB成像的结果与患者死后脑组织的病理检查非常一致[44-45]。作为第一个Aβ分子探针,PiB充分展示了体内Aβ脑成像的可行性。然而,PiB具有明显的局限性,限制了其在临床实践中的广泛应用。PiB的合成很复杂,11C标记的PiB的半衰期非常短(20 min)。Flutemetamol通过改进PiB的结构克服了这些缺陷[46]18F标记的flutemetamol的半衰期延长至120 min,其在体外实验中对Aβ具有高亲和力(Ki = 6.7nM)。临床试验表明,18F-flutemetamol成像结果与病理诊断一致[47]。2013年10月25日,18F-flutemetamol获得美国FDA批准,商品名为Vizamyl. Amyvid是18F标记的florbetapir,半衰期为110 min[48]。体外实验表明,18F标记的florbetapir对Aβ具有高亲和力(Ki=3.7 nmol/L)[49]。此外,florbetapir在Aβ上的结合位点似乎与PiB重叠,18F标记的florbetapir不与不相关的蛋白如Tau或突触核蛋白结合。临床研究表明,AD患者中18F标记的florbetapir脑成像检测与尸检结果一致[48]。Ⅲ期临床试验进一步表明18F标记的florbetapir它可以有效区分AD患者、MCI患者和正常老年患者[50]。Eli Lilly的18F-florbetapir于2012年4月10日获得美国FDA批准,商品名为Amyvid. Neuraceq是18F标记的florbetaben。同样,18F标记的florbetaben特异性结合Aβ斑块,但不结合Tau,突触核蛋白和其他蛋白质[51],脑成像结果和尸检高度一致,敏感度和特异度是分别为98%和89%。2014年,来自Pirama的18F-florbetaben被欧洲、美国和韩国FDA批准,商品名为NeuraCeq。
总体而言,Aβ脑成像技术是AD生物标志物研究取得的巨大进步[52],实现了AD患者脑部病理的可视化。然而,它们的局限性在于成本高昂和需要专业设备,而且PET成像不宜在短时间内重复进行。

4.3 AD的外周血生物标志物

与脑成像和CSF标志物相比,外周血的生物标志物具有无创、易于获取和性价比高等独特优势[53]。血液生物标志物在癌症的早期检测有应用广泛[54]。值得注意的是,大脑神经元中表达的大多数基因也在外周血细胞中表达,并且血细胞的基因表达模式与大脑基因表达模式存在相关性[55]。迄今已经有很多研究尝试在外周血中寻找神经系统疾病的生物标志物[56]。外周血的组分极其多样化,从蛋白质组学,基因组学到代谢组学等各种组学技术都被用来筛选外周血中的AD生物标志物。已报道的外周血AD生物标志物包括细胞因子、代谢物和基因表达谱等。有研究表明,血浆生物标记物可以作为诊断AD的生物标志物,但只有两项研究将血液蛋白与AD相关表型进行了比较,且在无症状个体中[57];另一项研究也表明血浆中的30种细胞因子可用于诊断早期AD患者,准确率超过80%[58];外周血白细胞的转录组可以诊断早期AD患者,准确率也超过80%[59]; microRNA表达谱也可用于诊断早期AD患者[60]。此外,外周血中的脂质代谢物可以预测正常认知的老年人未来发生AD的风险[61]
血液生物标志物在AD患者的早期诊断方面具有很大的前景,但是它也面临着以下挑战。首先,因为外周血远离大脑,单一的血液生物标志物的诊断准确性与Aβ脑成像或CSF Aβ42相比相对较弱。这可以通过多个血液生物标志物的组合来明显提高诊断的准确性。其次,与CSF生物标志物和Aβ脑成像相比,血液生物标志物的可重复性相对较差。在迄今为止报道的众多血液生物标志物中,大部分未能在独立研究中得到验证[62-63]。这可能是因为外周血生物标志物易受诸如个体差异,环境因素和其他疾病等混杂因素的影响。同时,血液生物标志物的多种检测方法也需要标准化[64]

5 结语

随着人类生活的延长和人口老龄化,AD将给家庭和社会带来巨大负担。尽管AD患者仍无有效的治疗方法,但过去失败的临床试验提供给我们的一个重要经验教训,即要早发现早治疗。因此,未来会有更多的研究尝试用生物标志物对患者进行分层,实现对AD的早期诊断并针对性地采取靶向药物或多种药物联合使用,以抑制Aβ产生、清除已有Aβ和保护重建突触和神经元,为AD的早期干预奠定基础。
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