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Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders

Abbreviation (ISO4): Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders      Editor in chief: Jun WANG

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2021 , Vol. 4 >Issue 3: 195 - 200

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.2096-5516.2021.03.005

Research Articles

Study on the behavior and blood index of TAUT transgenic rats

  • MAO Li-dong , 1 ,
  • FAN Wei-jia 1 ,
  • LI Xu 1 ,
  • WANG Chen 1 ,
  • QI Hao-ming 2 ,
  • TONG Hui-hui 2 ,
  • XIA Yi-ming 2 ,
  • HUANG Xiao-ling 2 ,
  • ZHANG Ling 1 ,
  • CHEN He-hong 1 ,
  • HUANG Hui-ling , 1
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  • 1 Tianjin Huanhu Hospital, Tianjin Neurosurgical Institute, Tianjin Key Laboratory of Cerebrovascular and Neurodegenerative Diseases, Tianjin 300350, China
  • 2 Gradute School, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China

Received date: 2021-05-08

  Revised date: 2021-06-12

  Online published: 2021-09-25

Fold

Abstract

Objective: To study the changes of cognitive ability and blood parameters in a brain-specific transgenic rat model of taurine transporter (TAUT) (TauT-tg rats). Methods: TauT-tg rats and negative rats (NON-transgenic, NTG rats) were selected. The morris water maze test was used to detect their learning and cognitive ability, and heart blood was collected to detect the changes in total protein, albumin, and alkaline phosphatase. As well as the changes of 30 blood routine indexes such as white blood cell count, red blood cell count, hemoglobin and platelets, etc. The brain tissues to the cortex and hippocampus were observed under electron microscope. Results: Compared with NTG rats, there is no significant difference in the over all positioning navigation latency of TauT-tg rats, while the proportion of TauT-tg male rats in the platform quadrant is significantly shorter on the 5th day. The total protein, Albumin of TauT-tg female rats are lower than that of NTG female rats. There is no difference in alkaline phosphatase,while the indicators of male rats are not significantly different, the blood routine index of TauT-tg and NTG rats are not significant sexual differences, but within the same group, the white blood cell count and red blood cell count of male rats were significantly higher than that of female rats, and there was no significant difference in hemoglobin, platelet and other indicators. Analyzing the ultrastructure of neurons and organelles in TauT-tg rats by electron microscopy showed that there was no significant difference between TauT-tg and NTG rats. Conclusion: Transgenic TAUT may improve the cognitive ability of male rats and has no effect on general blood indicators of rats, but may cause malnutrition in female rats.

Key words： Taurine transporter; rat; behavior; blood index

Cite this article

MAO Li-dong , FAN Wei-jia , LI Xu , WANG Chen , QI Hao-ming , TONG Hui-hui , XIA Yi-ming , HUANG Xiao-ling , ZHANG Ling , CHEN He-hong , HUANG Hui-ling . Study on the behavior and blood index of TAUT transgenic rats[J]. Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders, 2021 , 4(3) : 195 -200 . DOI: 10.3969/j.issn.2096-5516.2021.03.005

牛磺酸(Taurine, Tau),又名2-氨基乙磺酸,是机体中含量最丰富的游离氨基酸之一,存在于人类和大多数动物的大脑、心脏、视网膜和肌肉组织中[1,2]。研究已被证明牛磺酸在许多生理过程中发挥作用,可以促进大脑发育并调节大脑的多种功能,调节渗透压,维持细胞内和细胞外钙离子浓度、调节抗氧化应激反应,维持细胞膜的稳定性,促进细胞迁移,调节轴突生长等[3,4],显示出良好的神经保护作用。
牛磺酸不参与体内蛋白质的生物合成,主要依靠饮食摄人,牛磺酸内流和外流主要通过细胞膜上的钠/氯依赖性牛磺酸转运蛋白(taurine transporter, TAUT, Slc6a6基因编码)逆浓度梯度将血浆牛磺酸主动跨膜转运而来[5⇓~7]。
为研究牛磺酸对神经系统的作用中TAUT在脑内的转运机制,本课题组采用神经系统特异性启动子 PDGF 启动子, 利用转基因技术构建了在中枢神经系统特异性表达TAUT的转基因 SD 大鼠（TauT-tg大鼠）,并进行鉴定和繁殖,成功构建了TAUT转基因大鼠（TauT-tg大鼠）,并对其生理生化进行了一系列的检测,为后续研究 Tau 及 TAUT 在神经系统疾病中的作用和机制提供理想的模型。本实验就对TauT-tg大鼠的行为学和血液指标的研究做一总结。

1 材料和方法

1.1 TauT-tg大鼠的构建和分组

本课题组的TauT-tg大鼠是自行设计,并委托中国医学科学院北京实验动物研究所制作。将Slc6a6 CDs扩增后插入质粒PDGF4 (+)中,完成构建真核表达载体pDGF4(+)-Slc6a6,线性化后,用显微注射法将上述片段注射入假孕SD大鼠输卵管内,自然生产新生大鼠,鉴定后获得两只首建阳性鼠F0代（TauT-tg大鼠）,使用许可证号：SCXK(京)2013-0002。
大鼠饲养在SPF环境中（中国医学科学院放射医学研究所 许可证号：SYXK(津)2014-0002）首建鼠F0代与野生型SD大鼠（SPF级,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号：SCXK(京)2014-0004）合笼后,获得的F1代鼠,经过DNA鉴定和繁殖,选取TauT-tg大鼠杂合子13只（雌鼠6只,雄鼠7只）,NTG大鼠19只（雌鼠10只,雄鼠9只）,体重300g~550g,月龄4~ 9.5个月,平均26周龄。

1.2 试剂和仪器

XN-1000全自动模块式血液体液分析仪及配套试剂盒（日本SYSMEX公司）;AU5800系列全自动生化分析仪及配套试剂生化检测（美国Beckman Coulter公司）;BY-320C型医用离心机（北京白洋医疗器械有限公司）;水迷宫及动物运动轨迹跟踪系统（荷兰Noldus EthoVision）;H7650透射电子显微镜(日本日立)。

1.3 方法

1.3.1 TauT-tg大鼠的鉴定和繁殖[8]

详见参考文献[8]。在此简单描述：将F0代TauT-tg大鼠与野生型大鼠1:1合笼交配, 繁殖得到F1代大鼠,DNA鉴定筛选TauT-tg大鼠,后期同一父本母本的F1代大鼠TauT-tg大鼠雌雄继续合笼繁殖。采取出生后10d左右的脚趾,用全基因组提取试剂盒提取基因组DNA,PCR法对转基因大鼠进行基因型扩增,2%琼脂糖DNA电泳,阳性杂合子（TauT-tg大鼠） 的PCR扩增产物为625bp的DNA片段,NTG大鼠无此带。见图1
图1 marker : DL2000;H：水;N:阴性对照;P：阳性对照1,4：TauT-tg大鼠;2,3:NTG大鼠。

Fig.1 marker: DL2000; H: water; N:negative control; P: positive control; 1, 4: TauT-tg rats; 2, 3: NTG rats.

1.3.2 TauT-tg大鼠的Morris水迷宫实验[9]

Morris水迷宫由水池、平台和记录系统3部分组成。大鼠通用型圆桶：直径150cm,高60cm,盛水深50cm,水温22~24℃。将水池分为四个象限,平台置于第四象限水面下2cm。（1）定位航行实验：将受试大鼠按顺时针方向依次分别从4个象限的4个固定入水点将大鼠面向池壁放入水中,记录60s内寻找平台的时间（逃逸潜伏期）,如果在60s 内未找到平台,逃逸潜伏期记录为60s,计算大鼠在目标象限滞留的时间占比率和距离占比率,历时5天。（2）空间探索实验：训练5天后移除平台后,记录在60s内大鼠第一次到达原来平台所在象限区域内游泳的时间和穿越平台的次数,记录它们搜索平台的轨迹。检测大鼠对空间位置的记忆存储及提取再现能力。采用Noldus EthoVision 3.X系统进行记录和分析。

1.3.3 TauT-tg大鼠的脑组织电镜检测[10]

大鼠断头处死迅速分离出左侧大脑皮层和海马,切取皮层和海马CA3组织区约1mm3 数片。电镜样本制备：标本置2.5%戊二醛固定, 按常规方法清洗、固定、包埋和切片,再用醋酸铀饱和水溶液和枸橼酸铅染色,后置于透射电子显微镜下观察神经元细胞超微结构的变化,记录并照相。

1.3.4 TauT-tg大鼠的血液学检测

实验鼠禁食24h,100g/L水合氯醛按0.8ml/100g经腹腔注射麻醉后,暴露心脏穿刺左心室采血,分2管,1管置于促凝管内,室温放置2h,3000 r/min离心15 min取上清。用AU5800系列全自动生化分析仪检测总蛋白(TP)、白蛋白（ALB)、碱性磷酸酶(ALP)等生化指标。 另一管置于EDTA-K2抗凝管内,30分钟内采用XN1000型全自动血液分析仪及配套试剂进行检测。指标包括：白细胞(white blood cell, WBC)、红细胞(red blood cell, RBC)及相关指标（如血红蛋白浓度,红细胞压积等）,血小板(platelet, PLT)及其相关指标（如血小板平均体积等）, WBC分类（嗜碱性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比、成熟中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比等 ）等30项。采血后,按时间序列分别为30min、1.5h、3h将抗凝血做血涂片,经瑞姬染色后,油镜下观察细胞形态,计数棘形红细胞比率。
1.4 统计学方法：利用SPSS17.0软件和GraphPad Prism 6对数据进行处理,实验结果以均数±标准差（x±s）表示,两组间比较采用student-t检验,三组间组内比较采用方差分析。当P <0.05时有显著性差异,有统计学意义。

2 结果

2.1 TauT-tg大鼠鉴定（ 图1）。

2.2 TauT-tg大鼠的Morris水迷宫实验结果

2.2.1 定位航行实验：5天的训练,各组大鼠寻找平台的潜伏期开始逐渐缩短,各组大鼠的潜伏期没有差异（图2A）。随着实验时间的增加,大多数组大鼠在目标象限滞留的时间占比和空间距离占比逐渐增加,NTG大鼠雄性组比较,在第5天TauT-tg雄性大鼠时间占比和空间占比明显降低(图2B-2E)。两组的第1、5天定位航行实验移动轨迹（图2 H 、I）。
图2 TauT-tg大鼠和NTG大鼠的水迷宫实验：2A雌雄大鼠的定位航行潜伏期;2B、2C雄性大鼠、雌雄大鼠定位航行目标象限时间占比率;2D、2E雄性大鼠、雌雄大鼠定位航行目标象限距离占比率;2F雌雄大鼠空间探索达到平台时间;2G 雌雄大鼠空间探索穿越平台区次数。2H 、2 I NTG大鼠/TauT-tg大鼠 第1天和第5天的定位航行轨迹; 2J、2K 、NTG大鼠/TauT-tg大鼠第5天的空间探索轨迹。

Fig.2 Morris Water Maze of two groups(TauT-tg and NTG rats): 2A Escaping latency of place navigation ; 2B 2C The proportion of time in the target quadrant of place navigation ; 2D 2E The proportion of distance in the target quadrant of place navigation ; 2F The time to reach the palteform of spatial probe test ;2G The number of crossings platform area of spatial probe test; 2H 2 I Swimming track on the 5th day of place navigation in NTG and TauT-tg rats ; 2J 2K Swimming track on the 1th and 5th day of spatial probe test in NTG and TauT-tg rats.

2.2.2 空间探索实验：与NTG大鼠比较,TauT-tg -大鼠在到达平台时间和穿越平台区域次数上没有差异。（图2F、2G）;两组第5天的空间探索轨迹（图2J、2K）。

2.3 TauT-tg大鼠的脑组织电镜结果

与 NTG大鼠组比较,TauT-tg大鼠的脑皮层和海马细胞超微结构正常,神经元核膜、核仁清晰未见异常,细胞膜规整清晰,细胞质比较均匀,星形细胞异染色质未见异常,血管周围未见水肿,内质网及高尔基体排列正常,髓鞘形态未见异常。（见图3 A-D）
图3 NTG大鼠和TauT-tg大鼠脑组织电镜结果：A、B: NTG大鼠 和TauT-tg大鼠的大脑皮层,× 7000;C、D: NTG 大鼠和TauT-tg大鼠的海马,× 3000。

Fig.3 The image of electron microscopic of brain tissue in NTG and TauT-tg rats; A B: cerebral cortex of NTG and TauT-tg rats, × 7000; C D: hippocampus of NTG and TauT-tg rats,× 3000.

2.4 血液学检测

2.4.1 TauT-tg大鼠血液中总蛋白、白蛋白和碱性磷酸酶的生化指标检测

TauT-tg大鼠和NTG大鼠的雌雄总体、雄性和雌性分别比较,TauT-tg雌性大鼠的总蛋白、白蛋白均低于NTG雌性大鼠,碱性磷酸酶没有区别;而雄性大鼠各项指标无显著区别;组内的雌雄大鼠各指标无显著性差异。见表1。
表1 TauT-tg大鼠和对应NTG大鼠血项生化指标比较（x±s)

Tab. 1 Comparison of biochemical indexes between sex in TauT-tg and NTG rats (x±s)

检测项目 单位 TauT-tg 大鼠 NTG 大鼠 t值
雄性(n=7) ♂ 雌性(n=6) ♀ 雄 性 (n=7) ♂ 雌性(n=9) ♀ 雄性♂ 雌性♀
总蛋白(TP) g/L 60.11±2.32 61.53±3.00① 62.45±4.47 67.41±6.03 0.242 0.04①
白蛋白(ALB) g/L 28.62±1.55 29.63±1.41① 29.99±2.23 33.72±3.02 0.211 0.009①
碱性磷酸酶(ALP) U/L 110.28±30.55 87.00±20.53 126.28±38.84 89.40±35.37 0.409 0.884

Note: ①P<0.05, comparison between two groups of the same sex.

2.4.2 TauT-tg大鼠血项检测

TauT-tg大鼠的雌雄总体、雄性和雌性分别比较,与对应NTG大鼠各项指标均无差异性。但TauT-tg、NTG雄性和雌性大鼠组内分别比较,雄性大鼠的白细胞计数、红细胞计数均要显著高于雌性大鼠,血红蛋白、血小板等指标无显著性差别。4个主要指标检测结果见表2。
表2 TauT-tg大鼠与对应NTG大鼠的血液常规指标结果(x±s)

Tab. 2 Multiple comparison of blood routine indexes of TauT-tg and NTG rats (x±s)

检测项目(单位) TauT-tg 大鼠 NTG大鼠
雄 性(n=7) 雌性(n=6) 雄 性 (n=9) 雌性(n=10)
白细胞计数（×109/L） 8.03±3.80 5.05±2.25① 6.85±3.42 4.21±1.84①
红细胞计数（×1012/L） 10.14±0.65 8.48±1.21① 10.27±0.32 8.81±1.18①
血小板计数（×109/L） 1158.57±190.86 1115.40±203.81 1191.78±115.66 1089.64±165.94
血红蛋白浓度 （g/L） 170.85±9.67 150.25±20.61 169.55±8.60 159.92±20.86

Note: ①P<0.05, comparison between male and female in the same group.

2.4.3 TauT-tg大鼠血细胞图片结果

随着血液存放时间加长,大鼠的血涂片中棘红细胞的比率明显增高;TauT-tg大鼠和NTG大鼠变化无差异。而同时,人血涂片结果表明在3h内没有棘红细胞比率的变化。见表3。
表3 TauT-tg大鼠不同时段血涂片棘红细胞比率与人血涂片比较(x±s)

Tab. 3 Comparison of the ratio of acanthocytes at different periods of TauT-tg rats and human in the blood smear test (x±s)

时间 TauT-tg大鼠棘红细胞比率（%） 人棘红细胞比率（%） P值
0.5h 1.30±0.50 0.80±0.20 0.097
1.5h 35.40±4.80 0.90±0.20 0.001 ②
3h 86.00±3.40 1.00±0.20 0.001 ②
P值 0.001① 0.12

Notes: ①P<0.05, Comparison between different time; ②P<0.01, comparison between rat and human.

3 讨论

我们用显微注射技术构建的TauT-tg大鼠,我们前期的鉴定和繁殖文章已阐述其基因构建原理、产物表达及蛋白表达情况,实验显示其具有正常繁殖能力,与野生型大鼠无显著差异[8]。在组织中TAUT基因表达稳定,表明TAUT外源基因可以稳定整合到大鼠的基因组中,形成稳定品系。
Morris 水迷宫实验是行为神经科学中应用最广泛的评价动物空间学习记忆的实验方法[11]。本研究显示,经过5天训练后,TauT-tg雄性大鼠在平台象限里的距离时间占比率显著缩短,可以较快找到目标象限,结果表明转入TAUT基因,对雄性大鼠后期空间学习能力有所提高,而对雌性大鼠没有影响,但TauT-tg大鼠的总体定位航行潜伏期、到达平台时间和穿越平台区域次数较NTG大鼠均没有差别,又显示转入TAUT基因对大鼠的学习记忆能力几乎没有影响。这一结果还需要增加大鼠的数量进一步证实。
有报道显示：长期补充外源性牛磺酸可改善老年小鼠的记忆力[12]。最近的研究也支持高牛磺酸作为阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)一级和二级预防的有希望的候选者[13]。研究表明,通过口服喂食250 mg/kg/d的牛磺酸后,AD小鼠的空间记忆能力和海马记忆能力与野生型小鼠无显著差异。口服牛磺酸可以明显改善APP/PS1转基因AD小鼠模型体内的这种认知障碍[14]。牛磺酸作为抑制性神经传递的诱导剂、抗氧化剂、神经调节剂、钙稳态调节剂的作用,使其成为许多神经系统疾病如AD、帕金森氏病和亨廷顿舞蹈症等疾病的理想治疗剂。我们所构建的TauT-tg大鼠,可以为AD疾病的机制研究提供一个很好的模型。本实验只是先期研究这一模型的稳定性和生理生化指标,并没有加入外源性的牛磺酸,未能显示其作用,其行为学没有显著性改变。我们后期将制作AD等神经疾病模型进一步研究。
血液生理生化指标对人类疾病的发病机制等研究具有重要的指导意义。本实验结果显示：TAUT基因的转入,不会造成大鼠的白细胞、红细胞、血红蛋白及血小板计数等血项指标的变化,但同一组内的雌雄大鼠的白细胞计数、红细胞计数等有显著性差异,与前期文献报道不同。赵毓梅等研究显示[15],SD大鼠血常规中红细胞、白细胞、血红蛋白、以及血清中的总蛋白,雌雄鼠差别无统计学意义。究其原因,除了检测方法和取血方式不同外,雌雄大鼠血项指标可能与TAUT转基因有关。同时生化结果显示TAUT的转入,会造成雌性大鼠的蛋白质总量的减少,可能会导致其营养不良,后期增加实验动物数量和检测指标,得到进一步的可靠结果。
有趣的是,本次实验第一次发现大鼠的EDTA抗凝血染色,随时间的延长,红细胞会出现皱缩,变形,棘形红细胞比率明显上升,与转基因无关。而人类抗凝血图片染色在3h内无变化。这可能是由于大鼠红细胞细胞膜结构异于人类,其红细胞在EDTA环境中不适合长时间保存完好形态。因此,如需观察大鼠血细胞的形态,应尽快染色,或者避免使用抗凝剂,尽量采用血液直接涂片、染色的方法,避免抗凝剂的干扰。
查阅文献,这是第一次报道TauT-tg大鼠的稳定模型的行为学和血液指标的变化,为探索大脑内TAUT表达的机制提供了参考数据和指导意义,为研究脑内TAUT的表达高低在神经疾病中的作用提供了新的策略和方向,为后期研究奠定基础。

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