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Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders

Abbreviation (ISO4): Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders      Editor in chief: Jun WANG

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Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders >

2021 , Vol. 4 >Issue 3: 179 - 184

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.2096-5516.2021.03.002

Research Articles

Analysis of changes in gut microbiota of 5XFAD transgenic mice

  • LUO Zhi-yu ,
  • CHU Xing-kun ,
  • CHANG Shuai-shuai ,
  • FENG Yuan ,
  • YANG Da-bing ,
  • WANG Xin-yi ,
  • DU Xiao-guang ,
  • FENG Teng ,
  • ZHANG Jing
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  • Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co., Ltd, Shanghai 201203, China

Received date: 2021-05-13

  Revised date: 2021-06-12

  Online published: 2021-09-25

Fold

Abstract

Objective: To explore the gut microbiota changes of 5XFAD transgenic mice of Alzheimer's disease (AD) model compared with wild-type (WT) mice and the impacts of gender difference. Methods: The feces of different gender 5XFAD and WT mice were collected, and the bacterial 16S rRNA of fecal genomic DNA was amplified by PCR and sequenced by using high-throughput sequencing methods. Then, the differential and functional analysis of the sequencing data are carried out through nf-core and the bioinformation analysis method based on the R language platform. Results: In the composition analysis, compared to WT mice, 5XFAD transgenic mice had lower abundance of Epsilonbacteraeota and Proteobacteria at the phylum level. At genus level, 5XFAD transgenic mice had higher abundance of Alistipes and Lactobacillus and lower abundance of Helicobacter. In the functional analysis, compared to WT mice, 5XFAD transgenic mice had influenced different metabolism pathways. Besides, the composition and function of microbiota was different in a gender specific manner. Conclusion: The gut microbiota of 5XFAD transgenic mice is different from that of WT mice, and the difference is affected by gender.

Key words： gut microbiota; 16S rRNA high-throughput sequencing; 5XFAD

Cite this article

LUO Zhi-yu , CHU Xing-kun , CHANG Shuai-shuai , FENG Yuan , YANG Da-bing , WANG Xin-yi , DU Xiao-guang , FENG Teng , ZHANG Jing . Analysis of changes in gut microbiota of 5XFAD transgenic mice[J]. Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders, 2021 , 4(3) : 179 -184 . DOI: 10.3969/j.issn.2096-5516.2021.03.002

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种常见的神经变性疾病和痴呆形式,给全人类的社会和经济造成了沉重的负担[1]。AD的特征性病理标志是大脑中β淀粉样蛋白的沉积形成的斑块和高度磷酸化的tau蛋白形成的神经原纤维缠结[2]。尽管几十年来全世界对于AD治疗方法的研究做出了大量的投入和付出,但目前仍未找到有效的疾病修饰疗法,部分原因可能是对AD的发病原因理解有限[3]。
人体上存在着复杂的微生物群体,特别是在远端胃肠道系统（大部分是细菌）,微生物的数量约为人体细胞数量的10倍[4]。肠道微生物对于人体的健康有着关键的作用,包括能量获取、维生素的合成以及防止病原菌的过度生长和人体免疫系统的塑造[5]。
研究表明,肠道复杂微生态系统的改变与人类多种胃肠道和代谢性疾病息息相关,包括炎症性肠病、肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗和癌症[6,7]。最近,越来越多的研究显示,肠道菌群不仅在大脑的发育中扮演着重要的角色,而且也影响着中枢神经系统的功能[8]。在大脑、肠道和肠道内的菌群之间存在着一种被称为“脑-肠轴”的双向的连接通路,肠道菌群的改变会通过这种关系影响大脑的健康,影响诸如抑郁、自闭症、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化症和帕金森病等精神障碍病和神经变性疾病的发生和发展[9]。
因为AD与上述神经变性疾病有很多共性的病理特征,所以最近几年,科学家们也开始将更多的目光转向肠道菌群与AD发病关系的研究,以及基于此的AD的诊断方法和治疗手段研究[10⇓~12]。目前,已经有很多关于人体中肠道菌群与AD关系的研究报道,这些研究的结果均提示AD病人的肠道菌群在多样性和构成方面与正常人相比都发生了改变[13⇓~15]。另外,在AD的动物模型研究方面,与对照小鼠相比,经脑室注射Aβ1-42诱导的AD小鼠表现出了有差异性的肠道菌群构成,而在AD小鼠模型APP/PS1中,通过调节肠道菌群能够影响小鼠大脑内的淀粉样蛋白的沉积[16⇓~18]。然而,目前关于AD小鼠模型5XFAD中肠道菌群变化的研究相对较少,尤其是性别的影响缺少深入的研究。在本研究中,我们收集了14月龄AD转基因小鼠(5XFAD)和野生型(WT)小鼠的粪便,进行了粪便样品中提取DNA的细菌16S rRNA测序,通过生物信息学方法分析和鉴定不同遗传背景甚至性别下的肠道菌群差异。

1 材料和方法

1.1 实验动物

AD转基因动物模型5XFAD小鼠及其对应WT小鼠均购自Jackson lab的亲本鼠（品系号：34848-JAX）自行繁育而来。动物饲养于上海西普尔-必凯实验动物有限公司的SPF环境中。动物使用通过伦理委员会的同意。

1.1.1 分组

根据基因型鉴定结果,取出生日期相近的5XFAD小鼠和WT小鼠雌雄各5只,分笼饲养,直到14月龄大小。

1.2 小鼠粪便的收集

将每只小鼠放入干净的样品收集盒中,观察小鼠的排便情况,及时用干净的镊子夹取未被小鼠尿液污染的粪便放入对应小鼠标号的1.5毫升离心管中,4粒/只,收取及转运过程中离心管置于干冰上,最终转入-80℃冰箱存放。

1.3 DNA提取和测序

采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取小鼠粪便样本的DNA,对提取的DNA进行质检。对质检合格的DNA样本进行16s v3-v4区的扩增反应,扩增使用的引物序列为:338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。PCR产物经过质检和纯化后导入测序接头。构建好的文库经过进一步的纯化、质检和pooling后,进行变性、稀释和上机测序。

1.4 数据分析

原始数据的处理和质控采用nf-core中的ampliseq流程进行处理[19]。后续分析采用R(4.0.2)平台进行分析。利用R的phyloseq[20]、microbiome和microbiomeMarker进行数据差异分析和比对[21,22]。功能分析采用PICRUST2进行菌群的功能注释[23],差异的通路校正后P数值为0.05。

2 结果

为了观察AD转基因动物模型5XFAD小鼠与其对应WT小鼠的菌群差异以及性别的影响,我们收集了14月龄AD转基因小鼠(5XFAD)和野生型(WT)小鼠的粪便。先进行了粪便样品中提取DNA的细菌16S rRNA测序,再通过一系列生物信息学方法对测序数据进行了不同层面的差异分析和深入挖掘。发现了存在于两者之间的菌群差异以及性别影响,进一步功能预测提示了菌群可能的作用以及生物学意义。

2.1 5XFAD小鼠和WT小鼠的肠道菌群在扩增子序列变异(ASV)水平上存在差异

PCA (Principal Component Analysis, 主成分分析 ),是一种在菌群研究中最基本和常用的观察菌群结构差异的生物信息学分析技术。我们首先对两种小鼠的肠道菌群16S rRNA测序数据进行了ASV水平上的PCA 分析。结果（如图1）显示：5XFAD小鼠和WT小鼠的肠道菌群结构存在差异,不同性别和基因型小鼠主要分别聚为四类,其中不同性别小鼠中, 5XFAD小鼠更加聚集, WT性别差异更大;而不同转基因小鼠中,雄性和雌性5XFAD小鼠图中相对聚集偏上,雄性和雌性WT小鼠聚集相对偏下,提示不同基因型背景的雄性和雌性小鼠存在着差异。同时,为了进一步检验PCA分析的结果即图1的组间群落是否具有统计学差异,而检验组间群落差异本质上是检验距离矩阵之间的差异,我们利用了基于距离矩阵的PERMANOVA分析,结果表明,基因型和性别对肠道菌群群落都有显著的影响（基因型,F = 3.32, P<0.001;性别,F = 4.44,P<0.001）,这提示在后续的分析中需要按照基因型和性别差异两个维度进行进一步分析。
图1 5XFAD和WT小鼠的菌群PCA分析。黑色和蓝色标识分别为5XFAD小鼠的雌雄体,红色和黄色标识分别为WT小鼠的雌雄体;PC1提示第一方向可解释方差为13%,而PC2提示第一方向可解释方差为11%。

Fig. 1 PCA analysis of the gut microbiota in the 5XFAD and WT mice. The black and blue lines respectively represent the females and males in the 5XFAD mice, and the red and yellow lines respectively represent the females and males in the WT mice. PC1 indicates that the explanatory variance in the first direction is 13%, and PC2 indicates that the explanatory variance in the first direction is 11%.

2.2 5XFAD小鼠和WT小鼠的肠道菌群在门和属水平的菌群构成上存在差异

为了进一步观察两种小鼠肠道菌群的具体菌群差异,我们从分类学的角度对肠道菌群的构成进行了门和属水平上的相对丰度差异分析,结果见图2。
图2 5XFAD和WT小鼠在门（A）和属（B）水平上的相对丰度。X轴为WT和5XFAD雌雄四组小鼠,Y轴为菌群在该组样本中的比例,每个条目不同颜色代表不同的菌群,不同颜色条目的长度代表菌群中的比重。

Fig. 2 The relative abundance of gut microbiota in 5XFAD and WT mice at the phylum (A) and genus (B) levels. The X-axis indicates the four groups of mice: male WT and 5XFAD, female WT and 5XFAD. The Y-axis indicates the proportion of specific gut microbiota in the assigned group. The different colors of each band represent a different gut microbiota, and the length of the different color strip represents the proportion of the gut microbiota.

由图2A可知,小鼠粪便样本的菌群主要以拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、ε-变形菌门(Epsilonbacteraeota)和变形菌门(Proteobacteria)4个菌门为主。通过比较发现,四组小鼠的菌群构成在门水平上存在较大差异。不同性别小鼠中,Bacteroidetes在雄性5XFAD的丰度有所增加,Proteobacteria的丰度相对减少。在不同转基因小鼠中,与WT小鼠比较,5XFAD小鼠菌群中的 Epsilonbacteraeota和Proteobacteria丰富度普遍较低,而Bacteroidetes和Firmicutes的丰度略微升高,提示5XFAD小鼠中Epsilonbacteraeota和Proteobacteria菌的下调存在一定影响,同时5XFAD小鼠对肠道菌群的影响可能要大于性别的影响。
在属水平（如图2B）的不同转基因小鼠中,与WT小鼠相比,另枝菌属(Alistipes）和乳杆菌属(Lactobacillus）在5XFAD小鼠中丰富度明显较高,而螺杆菌属(Helicobacter）的丰富度则明显降低;不同性别方面,在WT小鼠中,拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus)和臭味杆菌属(Odoribacter)表现出了明显的性别差异。而在5XFAD小鼠中,只有Alloprevotella和Odoribacter表现出了性别差异,拟杆菌属(Bacteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus)在5XFAD中性别差异小,提示了不同基因背景下性别因素的差异性影响。

2.3 Lefse分析表明5XFAD小鼠和WT小鼠的肠道菌群在ASV和分类学水平上都存在差异

为了更深入地证明两种小鼠肠道菌群存在差异,我们又采用了Lefse（Linear discriminant analysis Effect Size, 线性判别分析）即LDA Effect Size分析。Lefse是一种发现和解释高纬度数据生物标识（分类单元、通路、基因）的分析工具,可以实现两个或者多个分组之间的比较,同时也可进行分组内部亚组之间的比较分析,从而找到组间在丰度上有显著差异的物种。这种方法可以用来分析菌群在不同水平上的差异。与传统统计非参数检验相比,lefse不仅进行非参检验寻找差异的特征,而且还进行了线性判别分析,这样可以使得投影后模式样本的组间距离最大,而组内矩阵最小,有利于在该模式空间具有最佳的分离性。LDA评分的默认值大于2和P值小于0.05作为差异显著的标准。 利用Lefse分析所示,5XFAD小鼠特异菌为Lactobacillus、Alistipes、Bacteroides、Odoribacter、Marvinbryantia、uncultured_rumen_bacterium、Ruminococcaceae_UCG-014、Muribaculum、Enterorhabdus、Ruminiclostridium_9等（图3）。
图3 5XFAD和WT小鼠的差异Lefse分析。图中不同颜色代表不同分组的小鼠,X轴代表LDA（Log）值,Y轴代表不同菌群的ASV水平,同时显示该水平在科和属水平的注释。

Fig. 3 Lefse analysis of the gut microbiota difference between 5XFAD and WT mice. The different colors in the figure represent mice in different groups. The X-axis indicates the LDA (Log) value. The Y-axis indicates the ASV level of different gut microbiota and shows the annotation of gut microbiota at the family and genus level.

此外,我们还发现5XFAD小鼠和WT小鼠的不同性别之间存在着菌群差异（如图4A,B）,而且同一性别的5XFAD小鼠和WT小鼠也存在差别（如图4C,D）。为了进一步展示性别差异对菌群的影响,我们将5XFAD小鼠中雌性和雄性有统计学差异的10个菌和WT小鼠中雌性和雄性有差异的16个菌群进行了维恩图交叉比较分析。结果显示,5XFAD小鼠中特有的菌有3个,而WT小鼠中特有的菌有9个。提示性别在WT小鼠菌群的影响大于5XFAD小鼠（如图5）。
图4 5XFAD和WT小鼠的性别差异Lefse分析。图中不同颜色代表不同分组的小鼠,X轴代表LDA（Log）值,Y轴代表不同菌群的ASV水平,同时显示该水平在科和属水平的注释。

Fig. 4 Lefse analysis of the gut microbiota difference of different gender between 5XFAD and WT mice. The different colors in the figure represent mice in different groups. The X-axis indicates the LDA (Log) value. The Y-axis indicates the ASV level of different gut microbiota and shows the annotation of gut microbiota at the family and genus level.

图5 5XFAD中雌雄差异的菌群和WT中雌雄差异菌群的维恩图。

Fig. 5 Venn diagram that shows the number of different gut microbiota in different gender 5XFAD and WT mice.

图6 肠道菌群功能分析。横坐标为每个通路百分比数值的平均值,纵坐标为Picrust2根据扩增子数据推断微生物群的功能注释;利用wilcox检测得到不同两组间差异通路（*:P<0.05, **:P<0.01）。

Fig. 6 Function analysis of gut microbiota. The X-axis indicates the average percentage value of each pathway. The Y-axis indicates the functional annotation of gut microbial community based on the amplicon data by Picrust2. The different pathways between the two groups were obtained by wilcox analysis (*:P<0.05, **:P<0.01).

2.4 5XFAD小鼠和WT小鼠的肠道菌群存在功能差异

通过上述分析我们发现了5XFAD小鼠和WT小鼠的肠道菌群结构和构成存在差异及性别影响,为了探究这种菌群差异潜在的生物学功能及影响,我们采用PICRUST2进行菌群的功能注释和预测。利用Pircust2分别对同一性别不同基因型以及同一基因型不同性别的小鼠菌群进行两组间的wilcox比较,得到差异显著的通路(P<0.05)。从图4中可以看出雄性小鼠中5XFAD小鼠相比WT小鼠影响的通路范围更加广泛,共有31条通路出现差异,其中5条是氨基酸相关代谢通路,比如色氨酸、组氨酸、赖氨酸等。而雌性小鼠中5XFAD小鼠相比WT小鼠影响的通路较少,仅有色氨酸、氯环己烷和氯苯的降解通路;免疫通路主要围绕类NOD受体信号通路。5XFAD不同性别小鼠主要影响了叶酸的合成通路,WT不同性别的小鼠主要影响硫胺代谢以及戊糖、葡萄糖醛酸相互转化的通路。从以上菌群功能注释分析的结果来看,基因型和性别不仅分别独自影响了不同的功能通路,而且互相交叉影响了不同的通路,提示了5XFAD小鼠与WT小鼠基因型和性别对菌群功能的差异影响,这些差异影响可能是导致不同基因型及不同性别小鼠差异表型的原因。

3 讨论

越来越多的研究表明肠道菌群能够通过“脑-肠轴”影响宿主大脑的功能进而影响宿主的行为[24,25]。而且越来越多的证据也提示在肠道菌群、认知和AD之间存在着联系。
在多项AD病人与肠道菌群关系的研究中,均发现了与年龄和性别对应的健康人相比,AD病人的肠道菌群出现了多样性降低和构成的改变,比如厚壁菌门(Firmicutes)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)的丰度降低和拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria）的丰度升高[13,15]。但在Aβ1-42诱导的AD小鼠模型中,结果却是相反的,即厚壁菌门(Firmicutes)的丰度升高而拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度降低[16]。AD转基因小鼠模型APP/PS1在8月龄的时候与同月龄野生型小鼠相比,其肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria）、疣微菌门(Verrucomicrobia)和放线菌门(Actinobacteria)的丰度降低,而拟杆菌门(Bacteroidetes)和软壁菌门(Tenericutes)的丰度升高,与人体中的报道具有一致性[18]。在本研究中,我们考察了14月龄的AD转基因小鼠5XFAD与同月龄野生型小鼠WT的肠道菌群差异,同时也考虑了性别因素的影响。通过使用不同的生物信息学分析技术对肠道菌群进行不同水平的差异分析,发现5XFAD小鼠和WT小鼠的菌群存在结构差异,并且这种差异受性别影响。菌群结构上,我们发现5XFAD小鼠菌群中的 Epsilonbacteraeota和Proteobacteria丰富度降低以及Bacteroidetes和Firmicutes的丰富度升高。此外,Lefse分析结果提示这种差异不仅在不同性别小鼠之间有差异,同时不同性别转基因小鼠也有共同的菌群特征,如共有菌群为Alistipes、Bacteroides、Lactobacillus。
同时,我们进一步进行了菌群功能的注释和分析,发现基因型和性别对菌群的功能也具有复杂的差异性影响,这些具有差异的功能通路指向了代谢（氨基酸、鞘脂、甘油磷脂等）和免疫（NOD通路）等功能,提示肠道菌群在代谢和免疫方面有一定的影响作用,为揭示肠道菌群结构差异与宿主表型差异之间的关系和作用机制提供了切入点。性别因素导致的差异影响是本研究相较于其它研究的创新之处,为以后AD和肠道菌群关系的研究提供了不可忽视的视角和方向。我们的研究发现与上述人体中和APP/PS1小鼠中的报道既具有一致性的地方也具有不同并发现了新的改变菌,这些差异和不同可能是由于物种、遗传背景和样本数量、测序等实验方法的种种原因导致的。这也提示了,在进行类似研究时,只有尽量增加样本数量并进行生命周期不同时间点的连续取样观察才能获得尽可能多的数据和结果,从而才能更好地阐明肠道菌群对AD的影响乃至最终能否对两者的因果关系下一个结论。这是本研究的不足之处,也是未来的研究重点和方向。另外,除了研究发现肠道菌群的结构变化对AD发生发展之外,菌群功能的变化与AD发生发展的生物学机制研究将会是该领域未来的研究重点。目前普遍认为,菌群代谢产物的变化影响了宿主机体的代谢、免疫和中枢神经的稳态[26]。
综上所述,本研究发现了AD转基因小鼠模型5XFAD的肠道菌群结构和功能都发生了改变,且这种改变具有性别差异。结果提示,5XFAD小鼠在研究肠道菌群与AD关系以及靶向肠道菌群治疗AD中具有应用的潜力。

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