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Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders

Abbreviation (ISO4): Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders      Editor in chief: Jun WANG

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Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders >

2019 , Vol. 2 >Issue 3: 408 - 415

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.2096-5516.2019.03.004

Research on effect and possible mechanisms of cutting formula of pantao pills on cognitive impairment in spontaneously hypertensive rats

  • GUO Manping 1 ,
  • SHI Weili 2 ,
  • ZHAO Junnan 1 ,
  • XIN Qiqi 2 ,
  • XU Fengqin 1 ,
  • CONG Weihong , 2 ,
  • CHEN Keji , 2
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  • 1 Institute of Geriatrics, Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences
  • 2 Cardiovascular Laboratory, XiyuanHospital, China Academy of Chinese Medical Sciences

Received date: 2019-05-31

  Revised date: 2019-06-08

  Online published: 2019-09-25

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Abstract

Objective: To observe the effects of the cutting formula of Pantao Pills on the cognitive function of spontaneously hypertensive rats (SHRs), and the possible mechanism. Methods: Wistar kyoto (WKY) rats were used as control group. SHR were randomly divided into model group, irbesartan+donepezil group, donepezil group, low-dose group of the cutting formula of Pantao Pills 3.07 g/(kg·d) and high-dose group of the cutting formula of Pantao Pills 6.14 g/(kg·d). Twelve rats in each group, half male and half female, were given orally once a day for 11 weeks. After 11 weeks of administration, cognitive memory function was examined by Morris water maze; morphological changes of brain tissue were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining; serum renin (REN) levels were measured by ELISA, and aldosterone (ALD) and angiotensin Ⅱ (Ang II) levels were measured by radioimmunoassay. Western Blot method was used to analyze phosphoinositide 3-kinase (PI3K), phosp-horylated-PI3K (p-PI3K), protein kinase B (AKT), p-AKT, extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), p-ERK1/2, p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK), p-p38 MAPK protein expression level in brain. Results: Compared with the control group, the swimming distance of SHR model group was significantly longer; the cortex and hippocampus of SHR model rats were loose, the density of neurons was decreased, and there were more vacuoles and cell fragments, the levels of PI3K, p-AKT and AKT protein in brain tissue of SHR model group were significantly lower, while the levels of p-p38 MAPK protein were significantly higher; compared with SHR model group, the swimming distance of SHRs in the water maze positioning and navigation test was significantly shortened in the high dose group (P=0.01) and the low dose group (P=0.003) of the cutting formula of Pantao Pills, the high dose group and the low dose group of the cutting formula of Pantao Pills significantly reduced neuronal damage and nuclear cohesion in cortex and hippocampus, decreased the pathological changes of hippocampus and cortical neurons; the high dose group of the cutting formula of Pantao Pills can up-regulate the level of brain PI3K (7^=0.021), p-AKT (P=0.000), AKT (7^=0.001) protein, down-regulate the level of brain p-p38 MAPK (P=0.001), p38 MAPK (P=0.008) protein. Conclusion: This suggests that the cutting formula of Pantao Pills can improve the cognitive impairment of SHRs and protect neurons. The mechanism may be related to the regulation of PI3K/AKT, p-AKT, AKT, p-p38 MAPK and other related proteins in brain PI3K/AKT and p38 MAPK signaling pathways of SHRs.

Key words： The cutting formula of Pantao Pills; Cognitive impairment; SHRs; PI3K/AKT; MAPK

Cite this article

GUO Manping , SHI Weili , ZHAO Junnan , XIN Qiqi , XU Fengqin , CONG Weihong , CHEN Keji . Research on effect and possible mechanisms of cutting formula of pantao pills on cognitive impairment in spontaneously hypertensive rats[J]. Chinese Journal of Alzheimer's Disease and Related Disorders, 2019 , 2(3) : 408 -415 . DOI: 10.3969/j.issn.2096-5516.2019.03.004

认知障碍常见于阿尔茨海默病(Alzheime's disease, AD )、血管性痴呆(vascular dementia, VD )、混合性痴呆以及全身性疾病如脑肿瘤、脑外伤、感染、中毒和代谢障碍等引起的痴呆疾病。引起认知障碍的发病机制复杂,目前研究认为其发生与多种遗传基因、AP代谢失调、神经递质改变、氧化应激、自由基损伤、脑出血、胆固醇代谢异常、胰岛素抵抗等有关[1⇓-3],涉及的信号通路包括PI3K/AKT[4]、ERK1/2[5]及 p38 MAPK[6]等。
蟠桃丸（又名清宫寿桃丸）为乾隆皇帝的保健养生秘方,20世纪80年代国医大师陈可冀院士主持挖掘清代宫廷医药档案时将其整理并用于大众,由人参、天冬、麦冬、枸杞子、地黄、当归、分心木等组成。近代研究表明,蟠桃丸不仅有养生保健作用,在老年认知障碍、高血压病、冠心病、糖尿病等治疗方面也有较好效果[7⇓-9]。蟠桃丸化裁方是蟠桃丸的精简方,以滋阴补肾、填精生髓为法,陈可冀院士临床上常用于治疗衰老、肾虚相关疾病。本实验通过观察蟠桃丸化裁方对SHRs认知功能的影响,探讨其改善SHRs认知障碍可能的作用机制,以期为蟠桃丸化裁方在此方面的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

12周龄SPF级WKY大鼠12只,SPF级SHRs 60 只,均雌雄各半,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号：11400700261047,许可证号： SCXK （京）：2016-0006。

1.2 药物

厄贝沙坦片（安博维,生产批号：J20130049）,每片0.15 g,由赛诺菲（杭州）制药有限公司提供;盐酸多奈哌齐（安理申,生产批号：H20070181）,每片5 mg,由卫材（中国）药业有限公司提供;蟠桃丸化裁方（组成：枸杞子、分心木等）,由中国中医科学院西苑医院制剂室提供。

1.3 主要耗材及仪器

ZS-001型Morris水迷宫系统,购自北京众实迪创科技发展有限责任公司;Stnergy-4型酶标仪,购自美国Biotek公司;HE染液,购自北京优博奥生物科技;PI3K抗体（货号4257S）、AKT抗体（货号4691S）、p-AKT抗体（货号4060S）、ERK1/2抗体（货号4695S）、p-ERKl/2 抗体（货号4370S）、p38 MAPK抗体（货号8690S）、p-p38 MAPK抗体（货号4511S）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）（货号5174）和抗兔二抗（货号5127）,均购自美国CST公司;p-PI3K抗体（货号YP0765）购自美国ImmunoWay公司;BX50型光学显微镜,购自日本Olympus公司。

1.4 分组及给药方法

大鼠于SPF级动物房适应性饲养3天后分为6组：对照组（WKY）、模型组（SHR）、阳性对照药厄贝沙坦+多奈哌齐组、阳性对照药多奈哌齐组、蟠桃丸化裁方低剂量组、蟠桃丸化裁方高剂量组,每组12只,雌雄各半。给予规律光照（昼夜各12 h）,自由饮食饮水,环境温度（20±2）℃,相对湿度45%~70%。给药组按60 kg体重成人日用量的6倍进行换算,厄贝沙坦+多奈哌齐组按厄贝沙坦片15.50 mg/(kg·d)+盐酸多奈哌齐0.52 mg/(kg·d)灌胃给药,多奈哌齐组按盐酸多奈哌齐0.52 mg/(kg·d)灌胃给药,蟠桃丸化裁方高、低剂量组分别按蟠桃丸化裁方6.14 g/(kg·d)、 3.07 g/(kg·d)灌胃给药,模型组及正常对照组予等体积生理盐水灌胃,每日1次,给药11周。

1.5 行为学实验

给药的第11周进行Morris水迷宫实验。首先进 行定位航行实验,实验开始前1天让大鼠自由游泳2 min,使其熟悉实验环境。正式实验持续4天。每个时间段4个象限除平台所在象限外各训练1次,共训练3次。每次训练取不同入水点,将大鼠入水平台设置为第一象限,同一天实验的大鼠用相同的入水点。 从3个起始点的任一点（相对固定）将大鼠面向池壁轻放入水池中,系统自动记录大鼠入水后找到平台的游泳时间即逃避潜伏期和游泳路径。系统自动记录大鼠训练过程,若在规定时间内（60 s）找不到平台的大鼠,即将其引导到平台。本实验最大潜伏期设置为 60 s,每次大鼠爬上或被牵引到站台后,使其在站台上休息15 s。每次训练完成后,间隔15 min再进行下一次训练,每天3次游泳实验。每只动物当天3次潜伏期及游泳距离的算术平均值作为该天该动物的学习记忆成绩。
定位航行实验训练结束后,第5天拿走站台,进 行空间搜索实验。记录大鼠在60 s内穿越原站台次数、 目标象限游泳距离百分比。

1.6 HE染色检测脑组织病理形态学变化

取大鼠脑组织,称重后固定在含有10%福尔马林 的磷酸盐缓冲液（pH7.4）中。将组织以5μm厚度连续切片并常规脱蜡至水（二甲苯I,二甲苯II, 100%乙醇I和100%乙醇II,各10 min。然后,95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和蒸偕水,各10 min）;苏木精染色1 min;在1%盐酸中分化,用水冲洗一次;曙红染色2 min;然后常规梯度醇（70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇和95%乙醇,每次2 min; 100%乙醇I及100%乙醇II各10 min）脱水;用二甲苯脱蜡,最后用中性胶固定。显微镜拍照并观察脑损伤的病理组织学变化。

1.7 Western Blot 检测

脑组织中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK1/2, p-ERK1/2, p38 MAPK、p-p38 MAPK 蛋白表达：将蛋白样品与5x十二烷基硫酸钠样品缓冲液（0.1 mmol/L pH 6.8的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,20%甘油,0.1%溴酚蓝,10%β-疏基乙醇,4%十二烷基硫酸钠）混合,100 °C下煮沸5 min,加载到10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳;将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上,5%脱脂乳封闭后用一抗浸渍。一抗为抗PI3K 抗体（1∶400）、抗 p-PI3K 抗体（1∶400）、抗AKT 抗体（1∶400）、抗 p-AKT 抗体（1∶400）、抗ERK1/2抗体（1∶400）、抗 p-ERK1/2 抗体（1∶400）、抗 p38 MAPK 抗体（1∶400 、抗 p-p38 MAPK抗体（1∶400）和抗GAPDH抗体（1∶400。一抗孵育过夜后,缓冲盐水洗涤膜3次,然后与辣根过氧化物 酶缀合的二抗孵育2 h。漂洗液洗涤3次后,将膜用电致化学发光底物溶液测定试剂浸渍直至出现清晰的条带。使用Gel-pro凝胶图像分析软件定量分析Western Blot结果,以GAPDH作为参考。

1.8 统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。实验数据表示为平均值±标准差（mean±SD）o在Morris水迷宫测试中,使用多因素重复测量方差分析测量的组之间的逃避潜伏期和游泳距离,通过单因素方差分析比较其他数据。以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蟠桃丸化裁方对大鼠认知功能的影响

2.1.1 定位导航实验

与WKY空白组相比,SHR模型组4天的游泳距离均明显延长（P< 0.01）;与SHR模型组相比,经过4天的训练后,厄贝沙坦+多奈哌齐组、多奈哌齐组、蟠桃丸化裁方低剂量组、蟠桃丸化裁方高剂量组的游泳距离均明显缩短（P< 0.05,或P< 0.01）,见图1。
图1 各组大鼠游泳距离

注：P< 0.01,与WKY空白组相比;P< 0.05, △△P< 0.01,与SHR模型组相比;n=12。

与WKY空白组相比,SHR模型组的逃避潜伏期 无统计学差异（P> 0.05 ）;与SHR模型组相比,厄 贝沙坦+多奈哌齐组第一天的逃避潜伏期明显缩短（P< 0.05,或< 0.01）,多奈哌齐组、蟠桃丸化裁方低剂量组、蟠桃丸化裁方高剂量组的逃避潜伏期在训练的4天内均无统计学差异（P> 0.05）,见图2。
图2 各组大鼠逃避潜伏期

注：△P< 0.05,与SHR模型组相比;n=12。

2.1.2 空间探索实验

各组间穿越平台次数、目标象限游泳距离百分比以及目标象限游泳时间百分比差异无统计学意义（P> 0.05 ）,见图3。
图3 各组大鼠空间探索实验结果

注：（a）目标象限游泳时间百分比;（b）目标象限游泳路程百分比;（c）穿越平台次数。

2.2 蟠桃丸化裁方对大鼠脑组织病理形态的影响

2.2.1 大脑皮质

脑HE染色后于400倍镜下观察,与WKY空白 组相比,SHR模型组大鼠脑组织疏松,皮质神经元密度降低,空隙增大,排列松散,并出现较多空泡和细胞碎片,基质着色变浅,部分细胞固缩深染。与SHR模型组相比,多奈哌齐组、厄贝沙坦+多奈哌齐组和蟠桃丸化裁方高、低剂量组大鼠的皮层神经元损伤性病理变化减弱,水肿、空泡样改变减少,神经元数目增加,核固缩边集明显减弱,见图4。
图4 各组大鼠脑组织皮层病理结构比较（HE染色,×400）

注：（A） WKY空白组;（B） SHR模型组;（C）厄贝沙坦+多奈哌齐组;（D）多奈哌齐组;（E）蟠桃丸化裁方低剂量组;（F）蟠桃丸化裁方高剂量组

2.2.2 大脑海马

脑组织HE染色后于400倍镜下观察,与WKY空白组相比,SHR模型组大鼠海马轮廓模糊,神经元细胞明显减少,可见到少许肿胀及变性的神经元细胞,细胞间距大,排列松散,界限模糊。与SHR模型组比较,各给药组大鼠海马组织形态学明显改善,少量神经元细胞的胞浆疏松淡染、神经细胞排列较整齐,见图5。
图5 各组大鼠脑组织海马区病理结构比较（HE染色,×400）

注：（A） WKY空白组;（B） SHR模型组;（C）厄贝沙坦+多奈哌齐组;（D）多奈哌齐组;（E）蟠桃丸化裁方低剂量组;（F）蟠桃丸化裁方高剂量组

2.3 蟠桃丸化裁方对大鼠脑PI3K/AKT、ERK1/2、p38 MAPK信号通路相关蛋白表达水平的影响

与WKY空白组相比,SHR模型组的p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白水平明显降低（P< 0.05,P< 0.01）, p-p38 MAPK蛋白水平明显升高（P< 0.01）;与SHR模型组相比,厄贝沙坦+多奈哌齐组、多奈哌齐组和蟠桃丸化裁方高剂量组PI3K、p-AKT、AKT蛋白水平明显升高（P< 0.05）, p-p38 MAPK, p38 MAPK蛋白水平明显降低（P< 0.05, P< 0.01）, p-PI3K蛋白水平变化无统计学意义。各组间 P-ERK1/2.ERK1/2蛋白水平差异无统计学意义（P> 0.05）,见图6。
图6 各组大鼠脑PI3K/AKT、ERK1/2、p38 MAPK信号通路相关蛋白水平

注：PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK1/2. p-ERK1/2. p38 MAPK、p-p38 MAPK 蛋白表达水平。*P< 0.05, **P< 0.01,与WKY空白组相比;*P< 0.05, **P< 0.01,与SHR模型组相比;n=3。

（A） WKY空白组;（B） SHR模型组;（C）厄贝沙坦+多奈哌齐组;（D）多奈哌齐组;（E）蟠桃丸化裁方高剂量组

3 讨论

随着人口老龄化的加剧,认知障碍已成为亟待解决的重大医学问题。数据表明,2015年我国AD患者人均年花费高达13.2万元人民币,到2050年患者总花费约49230亿元人民币[10],我国AD现状是“三高一低”：发病率高、致残率高、家庭负担重花费高、对疾病认识程度低;防治处于“三无”：无正确且直接的诊治生物标志物、无特异性治疗药物、无诊治信心。20世纪,人们已经认识到高血压是AD的危险因素。脑是高血压损害的靶器官,高血压必然会导致脑功能的损害[11]。研究表明,SHRs可以作为筛选认知功能紊乱治疗药物的动物模型[12⇓⇓-15]。
本实验以SHRs为认知障碍的动物模型,给药11周。结果显示,蟠桃丸化裁方能够显著缩短SHRs在定位导航试验中的游泳距离,提示蟠桃丸化裁方具有改善SHRs认知功能的作用。脑组织HE染色显示蟠桃丸化裁方组可以减轻SHRs海马和皮层神经元损伤性病理变化,减少神经元丢失,减弱核固缩边集现象,提示蟠桃丸化裁方对SHRs具有一定的神经保护作用。
研究发现,MAPK信号通路是细胞增殖、分化信号转导的共同通路。MAPK家族包括ERK（ERK1, ERK2, ERK3/4, ERK5, ERK7）,c-JunN端激酶和p38 MAPK[16]o MAPK可能对微管结合tau蛋白以及非微管结合tau蛋白都具有直接的磷酸化作用,从而导致AD中神经变性改变[17]。ERK1/2信号通路是经典的ERK信号转导途径,ERK1/2可被多种刺激因子激活,ERK1/2磷酸化是功能活动的标志[18]。p-p38 MAPK为p38 MAPK的活化形式,是参与神经细胞 凋亡的重要因素之一[19]。本实验结果显示,蟠桃丸化裁方能够显著降低SHRs脑组织p-p38 MAPK, p38 MAPK蛋白水平,提示其对p38MAPK信号通路具有调节作用。
PI3K/AKT信号通路是调节细胞增殖,血管生成和细胞凋亡的重要调节途径[20-21]。研究表明,PI3K/ AKT信号在AD脑中被下调[22],该途径的激活已被证明可以预防AP诱导的神经元毒性[23]。p-PI3K、 p-AKT为PI3K、AKT的磷酸化激活状态,可衡量该通路的活化程度[24]。本实验结果显示,蟠桃丸化裁方显著提高SHRs脑PI3K、p-AKT、AKT蛋白水平,提示其能够调节PI3K/AKT信号通路。
清代王清任《医林改错》明确指出“脑髓失充”为痴呆的主要原因,将痴呆的病位定于“脑”,“髓减脑消,神机失用”为基本病机。“髓减脑消”可由肾精不足、气血亏虚致髓海失充,亦可由痰瘀实邪痹阻脑络致清窍失养[25]。蟠桃丸化裁方中枸杞为君药,补肾滋阴益精,分心木为臣药,固肾涩精,诸药合用防治肾虚所致的诸多证候及相关疾病,如高血压、痴呆。本实验结果表明,蟠桃丸化裁方能够提高SHRs在Morris水迷宫实验中的学习记忆能力,保护神经元,其作用可能是通过调节PI3K/AKT、p38MAPK信号通路实现的。
综上所述,蟠桃丸化裁方可以明显缩短SHRs在水迷宫实验中的游泳距离,减轻神经元损伤,上调脑PI3K、p-AKT、AKT 蛋白,下调脑p-p38 MAPK、p38 MAPK蛋白,提示蟠桃丸化裁方可能通过调节PI3K/AKT、p38MAPK信号通路发挥改善SHRs认知障碍的作用。

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