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Journal of Materials Engineering

Abbreviation (ISO4): Journal of Materials Engineering      Editor in chief: Xiangbao CHEN

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2023 , Vol. 51 >Issue 11: 23 - 33

DOI: https://doi.org/10.11868/j.issn.1001-4381.2022.000847

REVIEW

Progress in application of nano-mimetic enzymes in reactive oxygen species detection

  • Yaxin DING 1 ,
  • Peng WU 1 ,
  • Xueling ZHAO , 1, 2 ,
  • Cheng CHEN 1, 2 ,
  • Donghai LIN 1, 2
Expand
  • 1. School of Energy and Materials，Shanghai Polytechnic University，Shanghai 201209，China
  • 2. Shanghai ;Engineering Research Center of Advanced Thermal Functional Materials，Shanghai 201209，China

Received date: 2022-10-11

  Revised date: 2023-07-10

  Online published: 2024-03-10

Fold

Abstract

Reactive oxygen species （ROS） as the substances with strong reactive activity， mainly include hydroxyl radicals （·OH）， superoxide anion radicals （· O 2 -） and hydrogen peroxide （H2O2）. Abnormal concentration of reactive oxygen species in mammals can cause serious diseases such as diabetes， cancer， tumors and some neurodegenerative diseases. Therefore， an increasing interest in the detection of ROS and issues was focused on and the consideration of the development of ROS detection sensors （e.g.， biocompatibility， stability of the detection method， variability of different types of ROS， etc.） were raised. In the past， electrochemical sensors based on natural enzymes have been developed， but the drawbacks of natural enzymes such as complicated preparation， difficult purification， poor catalytic activity and stability，which limit their research and application. In recent years， numerous studies have found that nano-mimetic enzymes have unique enzyme-like properties such as catalytic activity， selectivity and stability， which can be widely used to construct electrochemical biosensors for the detection of reactive oxygen species. Recent nano-mimetic enzyme sensors for the detection of · O 2 -， H2O2 and ·OH were focused in this paper， which are used in the field of life sciences to prevent related diseases in advance through the detection of reactive oxygen species， and can be used in the field of environmental pollution prevention and control for the quantitative detection of reactive oxygen species content.

Key words： reactive oxygen species; nanomaterial; nano-mimetic enzyme; electrochemical detection; sensor

Cite this article

Yaxin DING , Peng WU , Xueling ZHAO , Cheng CHEN , Donghai LIN . Progress in application of nano-mimetic enzymes in reactive oxygen species detection[J]. Journal of Materials Engineering, 2023 , 51(11) : 23 -33 . DOI: 10.11868/j.issn.1001-4381.2022.000847

活性氧（ROS）是细胞中产生的活性阴离子或中性高度不稳定小分子，主要包括过氧化物、· O 2 -、·OH、H2O2、单线态氧（1O2）、烷基过氧化物（ROO）和一氧化氯（ClO）。ROS是正常细胞系统中的重要组成部分，在调节生物体的各种生理功能中起着重要的作用［1］。低浓度时，ROS作为信号分子参与正常细胞代谢的生理活动［2］，但当ROS浓度不断升高时，它会引起细胞损伤［3］导致癌症、糖尿病、心脏病、肿瘤和一些神经退行性疾病［4］，这一现象被称为氧化应激［5］。ROS对环境科学、生命科学等领域的基础研究与应用都有着重要影响，因此对ROS的检测与定量分析有着重要意义［6］。目前已经存在许多用于定量测定ROS的分析方法（如荧光法［7］、分光光度法［8］、高效液相色谱法［9］、电子自旋共振法［10］、质谱法［11］、比色法［12］和电化学方法［13］），但在选择分析方法与检测手段时需要考虑以下问题：（1）不同种类的ROS具有不同的内在特性（寿命、扩散速率及生成源），这可能导致对其测量的不准确和不一致；（2）一些检测方案需要在细胞源上进行检测，还需要考虑所用传感材料的生物相容性；（3）ROS检测需要成本低廉、稳定性高、选择性好和灵敏度优异的检测技术。
电化学技术因其高灵敏度、高选择性、易于操作和直接定量等特点，已被证明是测定ROS的有效工具。近年来，通过研究天然酶的结构和催化特性，人们设计与合成了与天然酶活性相似的纳米模拟酶来代替天然酶。纳米模拟酶不仅比表面积大、生物相容性好、结构性能稳定，而且还具有化学与物理性质易于控制、成本低等优点。因此，纳米模拟酶常被用于构建生物电化学传感器（如谷胱甘肽［14］、葡萄糖［15］、胆固醇［16］、· O 2 - ［17］、·OH［18］以及H2O2 ［19］等生物小分子传感器）。本文主要总结了纳米模拟酶在活性氧（· O 2 -，·OH，H2O2）检测中的应用研究进展。

1 模拟酶

天然酶是在活细胞中产生的蛋白质，对底物具有高度特异性和催化性能［20］，不仅在生物体中表现出催化特性［21］，还能催化外部反应，模拟环境。由于这一特点，它们被广泛应用于疾病诊断、临床治疗、农业工程和食品加工等各个领域［22］。然而，天然酶很容易失活，苛刻的pH环境可能会使天然酶失去催化功能。此外，天然酶的提取和纯化过程也会造成其损耗并增加成本。这些天然酶固有的缺陷大大阻碍了它们的实际应用。
模拟酶是一种以主-客体化学［23］和超分子化学理论［24］为基础发明的具有天然酶类似催化活性的非蛋白类物质。主-客体化学的基本原理来源于酶和底物之间的相互作用，即主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补，这类似于酶与其所识别的底物的结合。超分子化学理论是根据酶催化反应机理有效地模拟酶分子的催化过程［25］，通过研究寻找出能与底物分子产生分子间相互作用的主体分子。
纳米模拟酶是具有酶活性的纳米材料，因其成本低、表面易修饰、稳定性强、活性可调等优点而受到人们的广泛关注。它能有效地克服天然酶成本高、稳定性差、可重复性差等缺点，并保持天然酶催化活性高和选择性好等特点。到目前为止，各种基于纳米模拟酶的分析传感器［26］已被用于检测各种离子、生物小分子（如过氧化氢、葡萄糖、乳酸、胆固醇和乙醇）、生物大分子（如凝血酶和DNA）和其他生物分子（如细胞、细菌或病毒）。

1.1 传统模拟酶

根据主-客体化学和超分子理论，已研究出了多种传统模拟酶。传统模拟酶不仅在耐酸碱、热稳定性方面优于天然酶，而且价格便宜，可大量应用于实际生产中。几种常见的传统模拟酶的介绍如下：
环糊精［27］是由多个葡萄糖单元组成的环状低聚糖［28］。环糊精的外缘亲水而内腔疏水，因而它能够像酶一样提供一个疏水的结合点，并作为主体包络各种适当的客体，如有机分子、无机离子以及气体分子等。因此，它经常被用作与其他材料结合的模仿酶的底物。
卟啉［29］是一类由四个吡咯环和四个内消旋碳以不同的方式排列形成的大分子杂环化合物，所得的卟啉异构体表现出非常不同的电子特性。研究表明，卟啉是一种具有丰富化学配位的多功能配体，它非常容易与所有金属/准金属/非金属形成络合物。因此，卟啉长期以来被广泛用于材料科学、生物学和医学等领域。
2020年，Fan等［28］通过CoⅢ-PPIX的CoⅢ和Py2CD的吡啶N之间的共价键实现了邻甲基化环糊精二聚体与钴原卟啉（CoⅢPPIX@Py2CD）的仿生组装（如图1所示），开发了用于检测H2O2的电化学传感器。该传感器检测线性范围较宽，检测下限为2.47×10-7 mol/L，为仿生载体的开发和生物的检测分析提供了一些建设性的启示。
图1 CoⅢ-PPIX@Py2CD的合成及其在过氧化氢检测中的应用［28］

Fig.1 Scheme of synthesis of CoⅢ-PPIX@Py2CD and its application for H2O2 detection［28］

在传统模拟酶中除了上述提到的环糊精模拟酶和卟啉类模拟酶外，还有分子印迹聚合物模拟酶［27］。分子印迹聚合物模拟酶是通过分子印迹技术（molecular imprinting technology，MIT）将功能单体与分子印迹模板通过交联剂聚合成分子印迹聚合物（molecular imprinted polymer，MIP），然后再将印迹分子从MIP中除去，只留下具有特定分子特异性识别功能的分子结构。分子印迹聚合物模拟酶在催化、固相萃取、传感器和抗体等许多方面得到了迅速发展。分子印迹聚合物模拟酶具有良好的储存稳定性、潜在的可重复使用性、简单的制备工艺以及易于与传感器集成等优点。
电化学方法灵敏度高，响应速度快且不需要复杂的仪器，这些特性使其与分子印迹聚合物模拟酶的结合在分析研究中有广阔的应用前景。2019年，Huang等［30］研究了一种用于检测·OH的分子印迹聚合物模拟酶传感器（如图2），该传感器以吡咯为功能单体，通过简单的电化学方法在还原氧化石墨烯（rGO）上印迹2，5-二甲基苯甲酸（2，5-DHBA）。该方法改善了2，5-DHBA的导电性和质量传输，增加了2，5-DHBA识别活性位点的可能性。
图2 MIPs/rGO传感器制备过程和检测·OH原理［30］

Fig.2 Preparation process of MIPs/rGO sensor and its ·OH detection mechanism［30］

除了上述提到的几种传统模拟酶外，其他的如冠醚类、杯芳烃类也受到了人们的关注。冠醚是一种简单的环状化合物，最常见的形式是环氧乙烷的大环低聚物［31］。其特征是可以通过不同的合成方法调节其空腔大小从而选择性地结合阳离子和中性物种［32］。胡伟等［33］发现杂氮冠醚化席夫碱钴（Ⅱ）配合物对磷酸二酯（BNPP）水解具有很好的催化活性。杯芳烃是由苯酚基和亚甲基或类似基团交替连接形成的环状低聚物。与冠醚相似，杯芳烃也具有可调节的疏水空腔，可以对金属离子和中性分子进行包络。Ozyilmaz等［34］通过将Fe3O4与杯芳烃的衍生物进行结合制备了一种包封脂肪酶，并研究其催化活性与稳定性。
相比天然酶，传统模拟酶在耐酸、耐碱、热稳定性等方面都具有优势，而且价格便宜，能大规模用于实际应用中。但是，传统模拟酶也存在合成较为复杂、催化活性位点单一、催化效率低以及分离、回收和再生较困难等缺点。

1.2 纳米材料模拟酶

纳米粒子是一类大小在1~100 nm 之间、具有独特的化学、电学、物理、力学性能的粒子［27］。由于纳米粒子具有不同于常规材料的尺寸效应、表面与界面效应和宏观量子隧道效应，在农业生产、汽车工业、食品加工、药物传递、电子产品、医学成像、化妆品、分析检测、建筑材料等领域得到了广泛应用。近年来，随着对纳米材料的深入研究，大量文献报道证实，纳米材料可以模拟多种天然酶的活性。
金属有机框架（metal-organic frameworks，MOFs）［35］材料是一类由金属离子和多元有机配体通过共价键形成的新型晶体材料。研究人员已经合成了不同类型的MOFs，并将其广泛应用于电分析领域。沸石咪唑框架（zeolitic imidazolate frameworks，ZIFs）作为一种常见的多孔MOFs材料，具有化学稳定性高、孔隙率均匀、比表面积大和结构可调节等优良特性。ZIFs可以作为模板和前驱体用于制备具有高导电性和热稳定性的多孔碳材料，通过不同的方式处理后可以作为类超氧化物歧化酶、类过氧化物酶、类氧化酶等。Wu等［36］开发了一种新型的过氧化氢电化学生物传感器。他们采用含钴金属有机骨架碳化工艺，制备了具有菱形十二面体形貌的纳米碳复合材料（Co-NC RDCs）。Co-NC是通过炭化ZIF-67前驱体得到的产物，它具有多孔结构、大的比表面积和高的电导率，且对过氧化氢具有独特的电化学传感性能。
金属纳米材料如金纳米颗粒（AuNPs）、铂纳米颗粒（PtNPs）、银纳米颗粒（AgNPs），氧化铈纳米颗粒［37］（CeO x NPs）等被广泛用于生物传感领域。AuNPs是一种海绵状结构，其有效表面积比相同体积的散装金膜大数百到数千倍。AuNPs同时还具有表面活性位点多、吸附力强、电子密度高等特点，能与多种生物分子结合而不影响其生物活性。因此，AuNPs在生物传感器中的应用为提高传感器性能和开发高效、新型生物传感器提供了可能性。铈离子可以在Ce3+和Ce4+之间可逆转换，使得Ce原子能够快速且大幅度地调整其电子结构（如产生氧空位或缺陷），以最佳的结构适应其周围环境，从而使得CeNPs具有优异的催化特性，可以用于清除各种毒性活性氧物质。2020年，Duanghathaipornsuk等［38］采用普鲁士蓝（PB）和Ce NPs以及氧化石墨烯（GO）制备了CeNPs/GO复合材料，将其作为电极材料构建了用于检测·OH的电化学传感器。该传感器对·OH的检测限为60 µmol/L。该项工作为开发检测·OH的电化学传感器提供了新思路。
与金属纳米酶相比，碳基纳米材料［39］具有更高的生物相容性和可调节的酶活性。如石墨烯［40］作为一种碳基纳米材料，由于其优异的导电率、比表面积高和成本低，在电化学传感方面具有非常大的应用潜力。Cui等［41］将锰（Ⅲ）四苯基卟啉（MnTPP）与电化学还原氧化石墨烯［42］（ERGO）复合得到具有超氧化物酶活性的MnTPP/ERGO纳米复合材料用于检测· O 2 -，检出限为0.039 μmol/L。石墨烯非常容易聚集导致其性能受到影响，这极大地限制了它的应用。将石墨烯羟基功能化可以解决它的团聚问题，通过增加含氧基团（羟基、羧基、氧）的数量来增加它在溶剂中的溶解性和分散性，还可以增大电化学传感器的活性表面积从而增强电化学性能。Aghamiri等［43］制备了氧化还原蛋白（Cyt-c）固定在电聚合聚苯胺（PANI）/羟基化多壁碳纳米管（cMWCNT）复合材料薄膜修饰在玻碳电极（GCE）上，并应用于H2O2的痕量检测。具有多孔结构的cMWCNT对蛋白质具有极高的负载能力，通过cMWCNT的石墨结构与PANI的芳香环之间的相互作用结合成cMWCNT/PANI。该材料具有良好的导电性和优异的电荷转移特性。Cyt-c/cMWCNT/PANI/GC传感器对H2O2的检测灵敏度为97.6 nA/（μmol/L），检测限为0.2 μmol/L，线性响应范围为2~600 μmol/L。
磷酸锰（Mn3（PO4）2）［44］是一种独特的锰盐，可通过歧化反应从水溶液中快速地去除超氧化物。Mn3（PO4）2对· O 2 -有极好的催化活性，并且生物兼容性好，因此Mn3（PO4）2可以作为纳米模拟酶用于· O 2 -的检测。Ding等［45］制备了一种基于石墨烯/脱氧核糖核酸/磷酸锰（Gr/DNA/Mn3（PO4）2）模拟酶的传感器，该传感器能快速、灵敏地检测· O 2 -。在该模拟酶中，利用π-π将DNA吸附在石墨烯上，一方面，在保持碳材料完整结构的同时可以对其进行功能化从而提高Mn3（PO4）2的催化性能；另一方面，将DNA吸附在石墨烯上还可以促进Mn3（PO4）2的均匀生长。该传感器成功检测到了癌细胞中释放的· O 2 -，在生物传感和生物医疗领域具有广阔的应用前景。
聚苯胺［46］（PANI）由于其高导电性和低成本，在众多导电聚合物中受到极大的关注。这些独特的性能使PANI适用于许多的领域（如燃料电池、超级电容器、电化学传感和生物传感等）。Gabunada等［47］通过湿法回流策略合成了基于磁铁矿纳米棒的聚苯胺/还原氧化石墨烯（Fe3O4@PANI/rGO）。该复合材料热稳定性好、活性表面积大、催化活性点多、导电性强。用Fe3O4@PANI/rGO构建的传感器对H2O2的灵敏度为223.7 μA/（mmol/L·cm2），LOD为4.45 μmol/L，检测范围为100 μmol/L~1.5 mmol/L。
通过一定的手段可以使上述提到的各种新型纳米材料具有更好的电化学活性，从而作为不同种类的纳米模拟酶与电化学技术结合，用于有效地检测活性氧物质，以促进对生物过程的理解和监测。

2 纳米模拟酶在活性氧检测中的应用

2.1 超氧阴离子（· O 2 -）的检测

· O 2 -主要是在氧分子的不完全氧化还原反应或在线粒体中产生三磷酸腺苷（ATP）时产生。在哺乳动物细胞中，· O 2 -在各种生理功能中发挥着关键作用［48］。虽然· O 2 -是在正常代谢过程中产生，并且是维持生理功能所必需的物质［49］，但其浓度是依靠酶的产生和抗氧化剂的清除达到平衡控制的。· O 2 -的浓度过高可能会使细胞周围的蛋白质被破坏并导致氧化应激反应［50］，引起的严重氧化损伤可能导致不同疾病［51］，如动脉粥样硬化、孤独症、帕金森病和阿尔茨海默病等［52］。因此，· O 2 -可作为早期病情诊断的潜在标志物，精确检测· O 2 -对于调查和了解氧化应激相关疾病的发展是必要的。接下来介绍几种检测· O 2 -的传感器。
Sadeghian等［53］制备了一种三维纳米金网电化学传感器（图3）。多孔金纳米网（NPGM）上附着Cyt-c并与工作电极结合，来测量药物诱导C2C12细胞的· O 2 -通过多孔膜的释放速率。该传感器对· O 2 -的灵敏度为7.29 nA/（nmol/L·cm2），最低检出限为70 pmol/L。该工作通过改变纳米金的的形貌来增加比表面积，提高了该超氧化物传感器的电化学性能。这项工作将为开发高灵敏度的分子电化学生物传感器提供了一个平台。
图3 细胞外超氧化物的电化学检测[53]（a）通过氧化还原蛋白（Cyt-c）与电极之间的氧化和直接电子转移来实现的传感机制；（b）细胞被界面连接功能化电极示意图

Fig.3 Electrochemical detection of extracellular superoxide［53］ （a）sensing mechanism realized by oxidation and direct electron transfer between redox protein （Cyt-c） and electrode；（b）schematic diagram of functional electrode connected by cell interface

除了上述提到的Au NPs以外，Pt NPs也可作为· O 2 -的催化剂与石墨烯相结合作为类超氧化物歧化酶。2019年，Hu等［54］通过电沉积将Pt NPs沉积在三维石墨烯泡沫（3D GF）上构建原位检测· O 2 -的三维传感平台。Pt@3D GF具超强的电化学活性，能使电荷转移电阻降低85%，且3D GF是一个具有生物相容性的平台，有较高的表面积且适合细胞附着/生长。该平台有明确的表面和界面特性，可实现从细胞中释放的· O 2 -的现场监测。此外，研究发现，在3D GF上沉积Pt NPs，减少了带负电荷的· O 2 -和电极表面之间的排斥力，使得3D GF有更高的电子转移速率和更好的电催化活性。
钴基纳米复合材料作为生物模拟酶用于催化· O 2 -现已经成为了研究人员的热点研究领域。Zhao等［55］ 采用简单、环保的微乳液方法合成了含有Co3（PO4）2，Co（PO3）2，Co2（OH）PO4和碳结构的Co基纳米复合材料（Co NCs）纳米模拟酶，构建了电化学传感器用于检测人脐静脉内皮细胞释放的· O 2 -（图4）。该传感器对· O 2 -检测的线性范围为3~150 nmol/L，检测限为1.0 nmol/L（S/N=3）。该研究为制备具有高灵敏度和耐用性的仿生酶传感器提供了一种新思路，为生物分析检测来自体内细胞或其他生物系统的化学信号分子提供了更多的途径。Zhang等［56］提出了一种简单的方法来合成由沸石类咪唑-67（ZIF-67）衍生的掺杂钴纳米颗粒的多孔立方碳（Co-PCC），用于构建检测· O 2 -的电化学传感器。而且基于此，研究人员还开发出了基于无酶无金属的碳纳米材料作为纳米模拟酶材料用于检测· O 2 -等物质的方法。Li等［57］以ZIF-8为模板，合成了两种新型的无酶无金属的碳纳米材料。一种是用单宁酸对ZIF-8进行化学蚀刻和热裂解，制备了空心立方碳纳米材料（HCC）。另一种是直接将ZIF-8煅烧得到多孔立方碳纳米材料（PCC）。这两种方式得到的碳纳米材料比原先的ZIF-8有更高的比表面积和更多的缺陷部位，这为制造具有优良特性的碳基类酶材料提供了一种潜在的方法。Liu等［58］报道了一种无酶和无金属的电化学传感材料，通过将中空介孔碳球（HMCS）掺氮处理得到掺氮中空介孔碳球（N-HMCS）。N-HMCS/SPCE电化学传感器可用于检测活细胞释放的· O 2 -，其对· O 2 -的灵敏度为1.49 μA/（mol/L·cm2）。
图4 钴纳米复合材料的制备及其对· O 2 -检测流程图［55］

Fig.4 Preparation of cobalt nanocomposites and its flow chart for · O 2 - detection［55］

相比于MOFs的不断改进，将磷酸锰与其他生物技术相结合应用于对· O 2 -的电化学传感也是一个较好的方向。Wang等［59］构建了一个基于细菌纤维素@脱氧核糖核酸-磷酸锰（BC@DNA-Mn3（PO4）2）的丝网印刷电极的活细胞传感界面。活细胞被固定在BC@DNA-Mn3（PO4）2纳米酶传感平台上，以快速、可靠地检测活细胞释放的· O 2 -。该类传感器在小型化、生物相容性、成本低和实时监测方面具有巨大的潜力。这项研究进一步表明，现有的构建活细胞传感界面的方法在未来的原位检测技术和下一代智能生物芯片、疾病诊断方面具有十分广阔的前景。
近年来，研究人员使用电化学技术将纳米模拟酶与特定的传感元件结合用于开发检测· O 2 -的电化学传感器。将有机材料与无机材料相结合用于改善电化学传感器的线性范围窄、检测限不够低等缺点，并提高传感器对· O 2 -的选择性、稳定性。表1 ［41，45，53-59］展示了用于· O 2 -检测的不同修饰电极的性能比较。
表1 用于· O 2 -检测的不同修饰电极的性能比较

Table 1 Comparison of the analytical performance of different modified electrodes for detection of · O 2 -

Electrode material Low detection limit/ （μmol·L-1） Linear range/ （μmol·L-1） Ref
MnTPP/ERGO 0.039 0.2-110 ［41］
Gr/DNA/ Mn3（PO4）2 0.00167 0.005-0.4 ［45］
Cyt-c/NPGM 0.00007 ［53］
Pt@3D GF 0.010 0.0325-1.04 ［54］
CoNCs 0.001 0.003-0.15 ［55］
Co-PCC 0.41 0.8-76.8 ［56］
HCC 0.140 0-112 ［57］
N-HMCS 2.2 20-480 ［58］
BC@DNA-Mn3（PO4）2 0.00587 0.0347-7 ［59］

2.2 羟基自由基（·OH）的检测

·OH在高级氧化过程（advanced oxidation processes）中作为主要氧化剂降解持久性污染物。但同时·OH也会破坏碳水化合物、核酸、脂类和氨基酸等生物分子，并对生物体和人类造成极大危害。·OH被认为是生物系统中产生的最强大的具有潜在危险的ROS，过量可能会导致细胞损伤［60］。·OH的浓度也与各种癌症［61］、糖尿病［62］和神经退行性疾病［63］（如阿尔茨海默病和帕金森病）有关，了解·OH浓度与这些疾病之间的关系有助于更好地诊断和预防。因此，开发能够快速分析·OH的灵敏检测方法是非常重要的。
Huang等［64］ 通过构建一个使用DNA和6-巯基己醇（MCH）的生物传感器，证明了DNA氧化损伤的程度与·OH的浓度有关。他们以氮掺杂的多孔碳材料和AuNPs作为信号放大器，进一步提高了电化学探针的灵敏度和最低检出限。通过电化学探针［Ru（NH3）6］评估·OH诱导的DNA损伤。该传感器具有良好的电导率，其检测限为25.0 μmol/L。
尽管上述基于DNA的生物传感器很容易制备，但DNA存在易降解等缺点，这极大地限制了它的实际应用。抗氧化剂被认为是防止自由基损伤的还原剂，Abdel-Hamid等［65］将咖啡酸（CAF）作为抗氧化剂，通过清除自由基来防止·OH的形成，这可以保护DNA不被降解。为了研究双链DNA（dsDNA）与咖啡酸（CAF）的相互作用并评估抗氧化性能，采用多壁碳纳米管固定dsDNA并作为玻碳电极修饰材料。在本研究中，同时研究了·OH对DNA造成的氧化损伤，并观察到在加入CAF后，由于其清除·OH的特性，dsDNA受到保护。该项工作能够构建生物传感器用于鉴定DNA损伤，对癌症、病毒感染等疾病的预防具有非常重要的参考意义。
除了通过直接的DNA氧化损伤程度来检测·OH的浓度外，还可以通过检测其他·OH捕获物来间接检测和判断·OH的浓度。Li等［66］将羧基功能化石墨烯（CFG）通过自组装单分子膜技术（SAMs）与乙二胺（NHCH2CH2NH）共价相互作用固定在玻璃碳电极（GCE）上，得到快速、灵敏检测·OH的CFG- NHCH2CH2NH/GCE电化学传感平台。在测定过程中，·OH的浓度不是直接获得的，而是采用4-羟基苯甲酸（4-HBA）作为·OH捕获物，间接测得·OH。
Duanghathaipornsuk等［67］提出了一种超灵敏的电化学传感器。该传感器由超小氧化铈纳米团簇（<2 nm）电沉积在丝网印刷碳电极（SPCE）上构筑而成。该电化学传感器的检测限（LOD）为0.6 μmol/L。此外，该纳米氧化铈电化学传感器在体外成功检测到新生小鼠骨组织的成骨细胞中存在·OH。为了最小化Ce NPs的尺寸，从而最大限度地增加用于·OH清除和检测的Ce3+位点的数量（式（1），（2）为氧化铈与羟基自由基反应原理），该团队采用表面有机金属化学（SOMC）合成策略来获得纳米级的CeO x，通过控制有机金属前体的负载来调整CeO x 纳米团簇的大小和分散性。超灵敏电化学传感器有望应用于医疗诊断、燃料电池技术以及食品和化妆品行业。
C e 2 O 3 + 2 ( · O H ) → O x i d a t i o n 2 C e O 2 + H 2 O
2 C e O 2 + H 2 O → R e d u c t i o n C e 2 O 3 + O 2 + 2 H +
在活性氧检测领域，对·OH的检测相对偏少，这是因为·OH具有较高的化学反应性，寿命极短（在生物系统中约为15 s），且难以在模型系统中进行检测并研究其与DNA损伤的关系。在众多研究中Ce NPs对·OH具有极高的选择性，这为·OH的检测提供了新思路。另外还可以通过直接判断DNA的损伤程度来检测·OH浓度或通过·OH捕获物间接检测·OH。表2 ［38，64，66-67］展示了用于·OH检测的不同修饰电极的性能比较。
表2 用于·OH检测的不同修饰电极的性能比较

Table 2 Comparison of the analytical performance of different modified electrodes for detection of ·OH

Electrode material Low detection limit/（μmol·L-1） Linear range （μmol·L-1） Ref
Ce NPs/GO 60 1-100 ［38］
NC/AuNPs/DNA/MCH 25.0 ［64］
CFG- NHCH2CH2NH 0.17 1.0-450 ［66］
Ce NPs 0.6 0.1-1000 ［67］

2.3 H2O2的检测

H2O2是一种简单、重要且功能强大的氧化剂，广泛应用于化工、临床应用、药物分析、食品制造和环境保护等多个领域。它不仅在化学和工业过程中产生，而且是人体中多种氧化代谢途径的副产物。为了保证生物功能的正常，H2O2浓度必须低于100 nmol/L［68］，高于此浓度会导致细胞的氧化应激和损伤［69］从而导致严重疾病［70］（如癌症、糖尿病、阿尔茨海默病和帕金森病等），甚至加速衰老。因此，实现快速、准确的检测H2O2至关重要。以下介绍几种用于检测H2O2的电化学传感器：
MOFs对H2O2的氧化表现出独特的电催化活性。Sherino等［71］制备了一种以己二酸（adipic acid）为连接剂和哌嗪（piperazine）为载体的镍金属有机材料（AP-Ni-MOF），并将其用作检测H2O2的电极材料（AP-Ni-MOF/CPE）。AP-Ni-MOF具有1.28×10-3 S·cm-1的高电导率，对H2O2的检测具有很高的电化学活性。AP-Ni-MOF/CPE检测范围是0.004~60 nmol/L，检测限为0.0009 nmol/L。AP-Ni-MOF/CPE电极在H2O2的实际样品检测（透镜清洁剂溶液）中表现出了良好的重现性、稳定性和选择性。Liu等［72］开发了一种新型的卟啉铁金属有机框架（pFeMOF）修饰的有序介孔碳（OMC），用于检测活细胞释放的H2O2。该pFeMOF/OMC复合材料是通过简单的一步水热法制备而成，Fe（Ⅲ）离子与卟啉基团的羧酸盐具有很强的配位作用，可以使合成的MOFs更加稳定。pFeMOF可以模拟过氧化物酶特性，获得良好稳定的电化学信号。此外，通过引入了OMC提高pFeMOF的导电率，同时OMC可以有效地控制pFeMOF晶体生长。这一策略改善了pFeMOF团聚从而使得更多的活性位暴露，提高了该复合材料的电化学活性。
在各类纳米金属与不同材料相结合的功能结合型材料中，除了金属框架的MOF外，碳基金属材料的导电性能也非常优异。Zhang等［73］将一维金纳米粒子（AuNPs）组装在磁性氮掺杂碳纳米管（NCNTs）上，再与细胞色素c（Cyt-c）结合制备出基于Cyt-c/NCNTs@Fe3O4@Au的传感器。其引入的AuNPs不仅不会破坏Cyt-c的天然结构，还能增强Cyt-c在电极表面的电催化特性。该传感器用于检测H2O2，其检测限低至0.3 µmol/L。
与同为碳基材料的碳纳米管相比，石墨烯具有更大的比表面积与稳定性，Zhao等［74］报告了一种快速制备银纳米粒子锚定激光诱导石墨烯（LIG@Ag）电极的方法，并用于H2O2检测。通过偏焦激光烧灼方法，银纳米粒子可以均匀分布在具有缺陷和微孔的层状结构的LIG纳米片上，LIG可以抑制银纳米粒子的尺寸增加，同时银纳米粒子也可以防止石墨烯纳米片的团聚。Ag NPs和LIG纳米片的协同效应使LIG@Ag电极在许多方面呈现出优异的电化学性能。该传感器具有良好的稳定性、重复性、选择性，对H2O2的检测限约2.8 μmol/L，灵敏度为28.6 μA（mmol/L·cm2）。由于LIG@Ag电极具有优异的导电性、机械灵活性和轻质等特点，该方法为大规模制造智能传感设备提供了一种新思路。
H2O2检测已经在工业领域和生物研究中获得了广泛的应用。在各种H2O2检测策略中，电化学因其高精确度和可靠性、良好的灵敏度和选择性、低检测限、快速反应和小型化引起越来越多的关注。随着纳米材料的快速发展，各种纳米材料被作为纳米模拟酶应用于生物传感领域。表3 ［36，43，47，71-74］为用于H2O2检测的不同修饰电极的性能比较。
表3 用于H2O2检测的不同修饰电极的性能比较

Table 3 Comparison of the analytical performance of different modified electrodes for detection of H2O2

Electrode material Low detection limit/（μmol·L-1） Linear range/ （μmol·L-1） Ref
Co-NC RDCs 0.143 1-30000 ［36］
Cyt-c/cMWCNT/PANI/GC 0.2 2-600 ［43］
Fe3O4@PANI/rGO 4.45 100-1500 ［47］
AP-Ni-MOF/CPE 0.9 4-60000 ［71］
pFeMOF/OMC 0.45 0.5-70.5 ［72］
Cyt-c/NCNTs@Fe3O4@Au 0.3 0.35-8.8 ［73］
LIG@Ag 2.8 10-550 ［74］

3 总结与展望

纳米酶已成为广泛用于各种领域的热门材料。特别是在生物传感领域，与天然酶相比，纳米模拟酶因其独特的催化活性，在检测活性氧的生物传感器的构建及应用中发挥着重要作用。部分纳米模拟酶作为电化学活性材料对一些特定的活性氧物质具有独特的催化性能，受到研究者的广泛关注。
随着与纳米模拟酶有关的研究迅速增加，纳米模拟酶应用于ROS检测的研究也取得了一定的进展，但在实际检测过程种还存在着一些问题，具体如下：
（1）目前的研究大多集中在通过调节纳米模拟酶的尺寸、形貌和结构来优化纳米模拟酶对ROS的催化性能，对纳米模拟酶中活性位点的研究还很缺乏。
（2）对纳米模拟酶与活性氧的催化机理的研究还不够深入，因此了解其催化机制对设计新型纳米酶和调节其活性具有重要意义。
（3）纳米模拟酶在应用过程中可能会与细胞内成分如蛋白质、核酸和小生物分子等发生相互作用，而导致其正常的生理功能的破坏。因此，有必要提高纳米模拟酶的生物相容性，以开发出新型电化学生物传感器，用于原位或实时检测ROS。
本文总结了纳米模拟酶在不同种类活性氧的电化学生物传感器方面的最新进展，讨论了其在当前研究中的不足之处，为今后的研究提供参考。我们期望对新型的纳米模拟酶进行进一步的研究开发，以提高其性能，加快发展纳米模拟酶在ROS检测和分析中的应用。

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