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2024 , Vol. 14 >Issue 4: 26 - 36

DOI: https://doi.org/10.11923/j.issn.2095-4050.cjas2023-0092

Grain-related Traits in Maize: Genome-wide Association Analysis and Candidate Gene Prediction

  • CHEN Xinyi ,
  • LIU Chenyan ,
  • HUA Mingzhu ,
  • XU Xin ,
  • FENG Wenxiang ,
  • WANG Baohua ,
  • FANG Hui
Expand
  • School of Life Sciences, Nantong University, Nantong 226019, Jiangsu, China

Received date: 2023-04-03

  Revised date: 2023-09-15

  Online published: 2024-04-17

Fold

Abstract

To explore the natural variations in regulating the maize kernel development and to assist in the genetic improvement of maize yield traits, in this study, 150 maize inbred lines with rich genetic variations were selected as materials for investigation. Combining 34,342 SNP markers and three models, a genome-wide association analysis was conducted on five grain-related traits. The results revealed that a total of 18 independent loci were significantly associated with the target traits, with each locus accounting for 12.24% to 15.41% of the phenotypic variations. Additionally, significant epistatic interactions were identified among four pairs of SNPs associated with kernel length, collectively explaining 5.32% of the phenotypic variations. By integrating the dynamic transcriptome data of kernel development in the B73 inbred line and functional annotations of genes, 19 candidate genes were predicted and classified into four categories: 6 enzymes, 3 ribosomal proteins, 1 transcription factor, and 9 other proteins. These candidate genes provide new genetic resources for deciphering the molecular mechanisms of maize kernel development and enhancing maize kernel size and yield. Through this research, we have not only uncovered the natural variations that regulate the development of corn kernels but also provided new genetic resources for the genetic improvement of corn yield traits. These findings are expected to bring new breakthroughs in corn breeding efforts, enhance corn production, and thereby better meet human needs for food.

Key words： maize; kernel size; yield; genome-wide association analysis; candidate genes prediction

Cite this article

CHEN Xinyi , LIU Chenyan , HUA Mingzhu , XU Xin , FENG Wenxiang , WANG Baohua , FANG Hui . Grain-related Traits in Maize: Genome-wide Association Analysis and Candidate Gene Prediction[J]. Journal of Agriculture, 2024 , 14(4) : 26 -36 . DOI: 10.11923/j.issn.2095-4050.cjas2023-0092

0 引言

玉米是中国最重要的粮食作物之一，被用作人类主食、动物饲料和工业原料。目前，中国玉米的种植面积和总产量均已超过水稻和小麦，在保障国家粮食安全上具有举足轻重的地位。根据预测，至2050年，全球玉米产量需要加倍才能满足人们日益增长的需求[1]，这使粮食安全问题变得日趋紧张。产量是玉米育种的第一目标，在日益严峻的环境胁迫下，如何持续稳定的提高玉米产量是一个亟待解决的问题。
籽粒的大小和重量是产量构成的重要因子，直接影响玉米的产量。阐明玉米籽粒大小和重量的遗传基础，挖掘与玉米产量相关的新基因，对提高玉米产量和指导育种工作具有重大意义。近年来，研究人员通过不同的方法成功克隆出许多与玉米籽粒发育相关的基因。这些基因包括编码线粒体核糖体蛋白的基因，如Dek44[2]、Smk4[3]、Ppr14[4]等；调控淀粉积累的基因，如，Bt2[5]、ZmNAC128、ZmNAC130[6]、ZmDof3等[7]；与激素调节相关的基因，如ZmTar1[8]、ZmPIN1a[9]；以及通过RNA编辑和剪切调控籽粒大小的基因，如Dek2[10]、Dek10[11]、Dek35[12]、UBL1[13]等。这些研究揭示了玉米籽粒发育复杂的调控路径。然而，目前的研究主要依靠反向遗传学方法，往往使用突变体研究基因功能。但是这些基因的功能突变可能导致严重的问题，如籽粒干瘪[14]，胚乳异常发育、败育[15]，空果皮[16]以及胚胎缺陷[17]等，因此，在玉米育种中的应用受限。与此相反，正向遗传学是由表及里的研究方法，通过观测表型的改变研究其内在的调控基因[18]，更易于发现植物的自然变异，有望在育种中应用。
数量性状位点(Quantitative trait loci, QTL)定位和全基因组关联分析(Genome-wide association mapping, GWAS)是解析复杂数量性状遗传结构的常用方法。近几十年来，成百上千个调控玉米产量相关的QTL被鉴定[18⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓-31]。例如，PENG等[24]利用2个F2:3群体在6个环境下鉴定到51~90个与玉米产量相关的QTL，其中包括7个主效QTL。CHEN等[28]利用一个重组自交系群体，结合包含2091个bins的高密度遗传图谱，鉴定到56个与玉米产量相关的位点，并筛选出一个编码含有SBP-box结构域的蛋白作为穗行数QTL (qKRN4-3)的候选基因。LIU等[29]通过10个重组自交系群体的研究，鉴定到729个调控玉米籽粒大小的QTLs，并进一步通过候选基因关联分析证实其中5个基因对玉米籽粒大小/重量有影响。同时，利用转基因技术验证了ZmINCW1的功能，指出其可能参与调控玉米籽粒大小/重量。此外，HU等[32]通过使用多亲本群体和3种统计模型，鉴定了18个调控玉米籽粒淀粉含量的QTL。结合区间关联分析和突变体技术成功克隆了一个调控玉米籽粒淀粉含量的基因ZmTPS9。该基因编码海藻糖-6-磷酸合成酶，突变后导致玉米籽粒淀粉含量增高，进而提高粒重，在玉米产量改良上具有潜在的应用价值。最近，CHEN等[33]利用一个重组自交系群体，鉴定到8个与玉米穗行数相关的位点，并通过图位克隆方法成功分离了qKRN2基因。该基因编码WD40蛋白，突变后能显著提高玉米穗行数，具有很大的增产潜力。此外，GWAS也被广泛应用于鉴定与玉米产量相关的基因。随着测序技术的发展，高质量SNP标记的获取变得容易，显著地促进了GWAS的应用[34⇓-36]。近些年，有多篇关于玉米产量相关性状的关联分析被报道[37⇓⇓⇓⇓⇓⇓-44]，鉴定了大量与玉米产量相关的显著SNPs及候选基因，如ATHB-4[40]，Br2[44]等。综上所述，尽管突变体研究在揭示玉米产量相关基因方面取得了一定进展，但在分子标记辅助育种的应用中面临一些挑战。相比之下，QTL定位和GWAS等正向遗传学方法在育种中具有巨大的潜力。利用正向遗传学手段，阐明玉米产量的遗传结构，鉴定优良等位基因，将有助于挖掘新的具有应用潜力的玉米产量功能基因，助力高产玉米的分子标记辅助选育和基因组选择育种。
本研究基于一个包含150份玉米自交系的关联群体，利用多种模型揭示了玉米籽粒相关性状的遗传结构，同时挖掘了调控这些性状的候选基因，这些发现为玉米高产的遗传改良奠定了坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料种植

本研究使用的关联群体材料包含150份EX-PVP或重要的公共自交系，于2019和2020年在江苏南通种植。采用随机区组试验，每个自交系单行种植，行长2.5 m，行距0.5 m，选择3~5株进行自交授粉。在成熟期收获后，进行自然晾晒和脱粒处理，妥善保存种子用于后续的表型鉴定。

1.2 表型测量和数据分析

所测表型性状为玉米籽粒大小相关的5个性状，包括粒长(Kernel length, KL)、粒宽(Kernel width, KW)、粒厚(Kernel thickness, KT)、百粒重(Hundred kernel weight, HKW)和籽粒体积(Kernel volume, KV)。具体测量方法为：随机选取20粒成熟的扁平籽粒，测量其总的长、宽、厚，并重复2次取均值，以得到单个籽粒的长宽厚；接着随机选取100粒籽粒，进行百粒重的测量，同样重复2次并取平均值；采用排酒精法对籽粒体积进行测量[44]，取20粒籽粒放入加有定量酒精的滴定管中，读取籽粒加入前后2次的读数，差值即为20粒玉米籽粒的体积，同样也重复2次并取平均值。利用SPSS软件对表型数据进行基本统计量分析、相关性分析和图形绘制。为消除环境效应的影响，利用R语言的lme4包对表型数据进行最佳线性无偏估计预测(Best Linear Unbiased Prediction, BLUP)[45]。广义遗传力的评估见公式(1)[46-47]。
H 2 = σ g 2 σ g 2 + σ g e 2 n + σ δ 2 n r
其中σg2为遗传方差，σge2为基因型与环境互作的方差，σδ2为残差，n为环境数，r为重复数。

1.3 基因型鉴定

利用美国Illumina公司开发的MaizeSNP50 BeadChip芯片[48]进行关联群体的基因型鉴定。该芯片包含56110个SNP标记，涵盖19350个玉米基因。利用plink1.5软件[49]对每个标记/个体的缺失率、杂合率和最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)进行筛选，最终有34342个MAF ≤ 0.05的多态性SNP用于后续分析。基因型分析的详细过程已在之前的研究中描述[50]。

1.4 群体结构和亲缘关系

利用Admixture1.3软件[51]对关联群体的群体结构进行分析，将其分成3个亚群。不同家系之间的亲缘关系系数是利用Tassel5.0软件的Centered_IBS算法[52]计算得出。

1.5 关联分析

将基因型和表型数据导入Tassel5.2软件，首先采用一般线性模型(General Linear Model, GLM)程序进行全基因组关联分析。随后，群体结构Q被用作协变量来校正群体结构对结果的影响。最后，利用混合线性模型(Mixed Linear Model, MLM)同时控制群体结构和亲缘关系[53]，对5个玉米籽粒相关性状进行全基因组关联分析。参考以前的研究，将阈值设置为P<1.0×10-4[29,50]。

1.6 上位性互作分析

在进行上位性互作分析时，选取的是每个显著的LD区域中P值最小的SNP。利用双尾方差分析估计单个性状鉴定到的所有位点之间的加性-加性互作效应[54-55]，将P<0.05设为显著性阈值。通过比较包含所有显著SNP效应和双位点互作效应的完整模型的残差与不包含双位点互作效应的简化模型的残差，评估上位性互作效应的大小。

1.7 候选基因的表达分析

候选基因的表达量数据来源于CHEN等[56]对玉米籽粒胚、胚乳和种子的动态转录组研究。我们选取了玉米授粉后的3个时期，10、20、30 d的数据进行分析。使用R语言的Pheatmap包绘制了表达热图。

2 结果与分析

2.1 玉米籽粒相关性状的表型数据分析

我们对150份玉米自交系进行了5个玉米籽粒相关性状（包括玉米籽粒大小和重量）的表型测定。结果显示，在该群体中，KL的分布范围为7.37~10.00 mm，平均值为8.75 mm，变异系数为5.83%；KW的平均值为8.17 mm，分布范围为6.82~9.08 mm，变异系数为4.53%；KT的均值为4.79 mm，分布范围为3.97~6.12 mm，变异系数为8.56%；KV为0.17 mL，分布范围为0.10~0.26 mL，变异系数为17.65%；HKW的变异系数最高，达到20.11%，平均百粒重为20.49 g，最大值为31.07 g，最小值为8.28 g（表1）。5个玉米籽粒相关表型的广义遗传力较高，分布范围为0.523~0.995，其中HKW的遗传力最高。这些结果表明玉米籽粒相关性状主要受遗传因素调控，受环境影响较小。大部分表型之间呈显著的正相关，相关系数为0.12~0.82（表2），其中，KV和HKW之间的相关性最高，而KT与KL之间相关性不显著。总的来说，5个性状均呈现出正态分布的趋势，变异较广泛（图1），表明玉米籽粒相关性状是复杂的数量性状，受多基因调控。
表1 5个玉米籽粒相关性状的描述性统计及遗传力
性状 自交系个数 最小值 最大值 平均值±标准差 变异系数 广义遗传力 置信区间
HKW/g 150 8.28 31.07 20.49 ± 4.12 20.11 0.995 0.994~0.997
KL/mm 150 7.37 10.00 8.75 ± 0.51 5.83 0.653 0.530~0.744
KW/mm 150 6.82 9.08 8.17 ± 0.37 4.53 0.916 0.886~0.938
KT/mm 150 3.97 6.12 4.79 ± 0.41 8.56 0.849 0.795~0.888
KV/mL 150 0.10 0.26 0.17 ± 0.03 17.65 0.523 0.354~0.647
表2 5个玉米籽粒性状之间的相关性
HKW KL KW KT KV
HKW 1 4.62E-16 5.70E-16 3.25E-11 3.32E-31
KL 0.65 1 3.34E-05 2.05E-01 4.87E-12
KW 0.65 0.36 1 3.42E-02 1.03E-09
KT 0.55 0.12 0.19 1 2.23E-09
KV 0.82 0.57 0.52 0.51 1

注：左下部分表示性状之间的相关性；右上部分表示P值。

图1 5个玉米籽粒相关性状的表型分布

2.2 玉米籽粒相关性状的遗传结构

2.2.1 一般线性模型分析

利用一般线性模型对150份玉米自交系的5个籽粒相关性状进行全基因组关联分析（图2a、b）。结果显示，共有18个SNP位点与5个玉米籽粒相关性状显著关联。每个性状可以鉴定到1~12个显著的SNP位点，分布在1、3、5、6、8和9号染色体上。考虑到SNP之间的连锁不平衡(LD)，将同一个LD区域的SNP合并后，共有12个独立位点能够调控5个玉米籽粒相关性状。每个位点可以解释的表型变异范围是12.49%~15.41%。其中，KL鉴定到最多的位点（10个），其效应值为12.51%~15.26%；最显著的位点是与KT显著关联的PZE-108040469，位于8号染色体上，P值为1.05×10-5，能解释15.35%的表型变异；HKW只检测到1个位于6号染色体上的显著独立位点，P值为7.25×10-5，能解释的表型变异为12.74%；只有一个位点与KW显著关联，位于3号染色体上，P值为1.1×10-5，能解释15.41%的表型变异；KV也只鉴定到一个显著位点，位于2号染色体，能够解释13.6%的表型变异。
图2 不同模型玉米籽粒相关性状的全基因组关联分析

HKW，百粒重；KL，粒长；KT，粒厚；KW，粒宽；KV，籽粒体积，下图同；

a：一般线性模型的关联分析结果；b：一般线性模型的QQ图；c：Q模型的关联分析结果；d：Q模型的QQ图；e：混合线性模型的关联分析结果；f：混合线性模型的QQ图

2.2.2 Q模型分析

通过Q模型共检测到10个SNP位点与5个玉米籽粒相关性状显著关联，分布在1、2、3、6、8和10号染色体上，每个性状可以检测到1~4个位点，每个位点解释的表型变异范围为12.24%~15.30%（图2c、d）。同样，考虑到LD的影响，共有8个独立位点能够调控籽粒大小相关性状。其中，2个位点是新鉴定到的，即HKW和KV共同检测到SYN29761，位于1号染色体上，分别解释14.29%和13.51%的表型变异。另一个新鉴定到的位点是位于8号染色体与HKW显著关联的PZE-108019862，能解释12.47%的表型变异，其余6个位点在一般线性模型中已经被鉴定到。

2.2.3 混合线性模型分析

通过混合线性模型共检测到3个独立位点SYN29761、PZE-106060527和PZE-108040469分别与HKW、KT和KL显著关联。KV和KW未鉴定到显著位点。这3个位点分布在1、6和8号染色体上，每个位点解释的表型变异分别是14.29%、15.41%和15.29%（图2e、f）。这3个位点均在一般线性模型或Q模型中被鉴定到。综合3种模型结果共鉴定到16个独立位点与5个玉米籽粒相关性状显著关联，分布在除4、7号之外的8条染色体上（表3）。
表3 5个玉米籽粒相关性状的全基因组关联分析结果及候选基因预测
性状 标记 染色体 物理位置 P值 R2/% 候选基因_V3 候选基因_V4 功能注释 备注
KL PUT-163a-4730462-2143 1 49131053 7.94E-05 12.51 GRMZM2G038015 Zm00001d028879 bZIP-transcription factor 24
KL PZE-101070408 1 53158367 5.13E-05 13.56 GRMZM2G107463 Zm00001d028989 RING/U-box superfamily protein
HKW SYN29761 1 90219767 2.75E-05 14.29 GRMZM2G154487 Zm00001d029887 Ribosomal L18p/L5e family protein
KV PZE-102077877 2 60656421 5.47E-05 13.80 GRMZM2G016749 Zm00001d000124 Protein-serine/threonine phosphatase
KW PZE-103124207 3 181695567 1.10E-05 15.41 GRMZM2G386991 Zm00001d042938 Serine/threonine-protein kinase AFC1
KL ZM013522-0530 3 222667473 1.22E-05 15.26 GRMZM5G866024 Zm00001d044376 membrane protein
KT SYNGENTA2236 4 5010855 8.07E-05 12.86 GRMZM2G101502 Zm00001d018506 Deoxyhypusine hydroxylase 条件
分析
KL SYN3700 5 216163416 1.93E-05 14.62 GRMZM2G101571 Zm00001d018507 bet1 sft1-related snare
KL PZE-106060527 6 109295972 1.13E-05 15.25 GRMZM2G048194 Zm00001d037151 erwinia induced protein 1
KV PZE-106082684 6 139912054 9.34E-05 12.71 GRMZM2G068496 Zm00001d037972 60S ribosomal protein L29 条件分析
GRMZM2G068323 Zm00001d037975 pentatricopeptide repeat-containing protein
HKW SYN38610 6 165943896 7.25E-05 12.74 GRMZM2G132929 Zm00001d039106 40S ribosomal protein S12-like
HKW PZE-108019862 8 17889483 8.97E-05 12.47 GRMZM2G080722 Zm00001d008736 Monothiol glutaredoxin-S4, mitochondrial
KT PZE-108040469 8 65972918 1.05E-05 15.35 GRMZM2G021331 Zm00001d009488 ATP synthase beta chain
KL PZE-108113799 8 164939218 7.41E-05 14.74 GRMZM2G049269 Zm00001d012211 ankyrin-like protein
KL PZE-109030021 9 33672066 7.05E-05 12.78 GRMZM2G065355 Zm00001d045724 heat shock factor-binding protein 1
KL SYN32340 9 90842290 6.11E-05 13.20 GRMZM2G056166 Zm00001d046531 bri1-kd interacting protein 118
KL PZE-109077339 9 124770857 2.27E-05 14.39 GRMZM2G113866 Zm00001d047335 sigma factor sigB regulation protein rsbQ
KL PZE-110109454 10 148515533 9.38E-05 12.24 GRMZM2G173636 Zm00001d026639 acyl-binding domain-containing protein 6

2.2.4 条件分析

为进一步探究基于3种模型鉴定到的显著SNP位点之外，是否还有其他位点调控玉米籽粒相关性状，将这16个显著位点作为协变量进行了条件分析。结果表明，另有2个新的位点分别调控KT和KV性状（图3）。与KT显著关联的位点为SYNGENTA2236，位于4号染色体上，P值是8.06×10-5，能够解释12.86%的表型变异。而位于6号染色体上的PZE-106082684，与KV显著关联，P值为9.34×10-5，解释的表型变异为12.71%。
图3 5个玉米籽粒相关性状的条件分析

a：Q模型的条件分析；b：Q模型的QQ图；c：混合线性模型的条件分析；d：混合线性模型的QQ图

综上所述，通过不同的统计模型和条件分析，分别鉴定到3、10、2、1和3个位点与HKW、KL、KT、KW和KV显著关联，利用一般线性模型估算这些位点解释的表型变异，结果发现与HKW显著关联的位点共可解释22.79%的表型变异，与KL关联的位点共可解释53.39%的表型变异，与KT显著关联的位点共可解释22.63%的表型变异，与KW显著关联的位点共可解释15.41%的表型变异，与KV显著关联的位点共可解释20.13%的表型变异。

2.2.5 上位性互作

为进一步分析玉米籽粒相关性状是否存在上位性互作效应，利用一般线性模型评估了同一性状下显著位点之间的加-加互作效应。结果显示，只有KL性状存在上位性互作效应。共鉴定到4对上位性互作，包括PUT-163a-4730462-2143与ZM013522-0530和PZE-109077339之间的互作、PZE-101070408与PZE-110109454之间的互作以及PZE-108113799与PZE-109077339之间的互作（表4）。这些上位性互作共可解释5.32%的表型变异，表明在该关联群体中，KL表型的遗传结构比其他表型更加复杂。因此，综合考虑加性效应和上位性效应，与KL显著关联的位点共解释了58.71%的表型变异。
表4 玉米籽粒相关性状的上位性互作分析结果
性状 SNP1 SNP2 P值 add_R2/%a epi_R2/%b
KL PUT-163a-4730462-2143 ZM013522-0530 0.02 53.39 5.32
KL PUT-163a-4730462-2143 PZE-109077339 0.03 53.39 5.32
KL PZE-101070408 PZE-110109454 0.02 53.39 5.32
KL PZE-108113799 PZE-109077339 0.01 53.39 5.32
KV - - - 20.13 -
KT - - - 22.63 -
HKW - - - 22.79 -
KV - - - 15.41 -

注：a表示与性状显著关联的加性位点解释的表型变异；b表示与性状显著关联位点的上位性互作解释的表型变异；“-”表示无上位性互作。

综上所述，在该群体中，玉米籽粒相关性状受多基因调控，显著SNP的加性效应对其遗传结构的贡献比SNP之间的上位性效应更大。

2.3 候选基因分析

考虑到LD的影响，从18个显著SNP位点的前后50 kb区间内筛选出82个候选基因。在一个公共的玉米转录组数据库中，获取了其中81个基因在玉米胚、胚乳和籽粒的表达量数据[56]，其中，32个基因在玉米胚、胚乳和籽粒的不同发育时期均不表达（FPKM<1，附图1）。结合表达量数据和功能注释信息，筛选出19个候选基因（表3）。随后，对这些基因进行了功能注释分类（图4），发现其中6个基因编码酶或编码具有酶活性的蛋白：Zm00001d000124编码丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，Zm00001d042938编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，这2个酶能将丝氨酸/苏氨酸磷酸化或去磷酸化，从而激活或抑制目标蛋白质的功能，进而调控基因的功能；Zm00001d018506编码脱氧辅蛋白羟化酶，该酶催化亚精胺到高赖氨酸的生物合成途径中的最后一步，属于翻译后的修饰过程。在该过程中，包含高赖氨酸的蛋白eIF5可能参与调控蛋白质的翻译[57]；Zm00001d009488编码ATP合酶β链，与细胞的能量供应相关；Zm00001d012211编码假定的甲基转移酶，可能在表观水平对籽粒发育进行调控；Zm00001d047335编码假定的脂酶。只有一个候选基因具有转录因子活性(Zm00001d028879，bzip24)，它编码bzip转录因子24，具有与特定DNA序列结合的能力，可以调控下游基因的表达；另有3个候选基因编码核糖体蛋白：Zm00001d029887编码核糖体L18p/L5e家族蛋白，Zm00001d037972编码60S核糖体蛋白L29，Zm00001d039106编码40S核糖体蛋白S12。鉴于核糖体是蛋白质合成的重要场所，这些基因能够参与核糖体的构成，可能通过影响蛋白质的合成、修饰等过程调控籽粒发育。除此之外，其他候选基因编码不同类型的蛋白质，包括含有五肽重复序列的蛋白质（PPR蛋白，Zm00001d037975）和热休克蛋白(Zm00001d045724)等。
图4 玉米籽粒相关性状候选基因的功能分类

3 讨论

关联分析在解析复杂数量性状的遗传基础和克隆功能基因上具有明显的优势[58]。近年来，通过关联分析方法已经成功克隆了多个基因，如与产量相关的ZmINCW1[29]、与抗旱相关的ZmVPP1[59]、ZmNAC111[60]、TaNAC071-A[61]等，与耐盐性相关的ZmHAK4[62]、ZmCLCg、ZmPMP3[63]和ZmNSA1[64]等，与耐冷性相关的ZmMPK8[65]、与抗病性相关的ZmFBL41[66]以及与花期相关的ZmCCT[67]等。目前，大多数与玉米产量相关的基因都是通过突变体克隆获得的，但这类基因的突变往往导致籽粒干瘪、败育，难以在育种中应用。相反，利用关联分析鉴定调控玉米产量的自然变异，有利于玉米自交系的定向改良。本研究使用3种统计模型对5个玉米籽粒相关性状进行了全基因组关联分析，鉴定到18个位点与玉米籽粒大小和重量显著关联，其中，约72%(13/18)的位点与其他研究共定位[28-29]，5个位点是本研究新鉴定到的，这在一定程度上说明了本研究结果的可靠性。由于单个位点的效应并不高(12.24%~15.41%)，综合多个位点及上位性互作，KL性状所解释的表型变异最高(58.71%)，其他性状只能解释20%左右的表型变异。这些遗传力的缺失表明在该关联群体中可能仍存在很多调控玉米产量的基因，或者是基因与基因之间的互作尚未被鉴定到。这可能与标记密度低、群体规模较小导致的检测功效较低有关，也说明了玉米籽粒性状的遗传复杂性。
根据基因在籽粒中的表达量及其功能注释分析，本研究筛选出19个候选基因。其中值得关注的是一个尚未报到的影响玉米籽粒相关性状的PPR蛋白基因-Zm00001d037975。PPR(Pentatricopeptide Repeat)是一种三角状五肽重复结构域，是陆生植物中最大的蛋白家族之一，在大多数植物中拥有超过400个成员，在植物生长发育过程中发挥着至关重要的作用[68-69]。先前的研究表明，PPR蛋白的突变或功能缺失会严重影响玉米籽粒的发育，导致胚、胚乳的败育或籽粒大小的改变[4,70⇓⇓-73]。例如，通过影响线粒体特定转录本的碱基编辑来影响线粒体的功能，进而导致籽粒败育的EMP5和EMP9等[70,72]；通过调控nad2内含子的可变剪切来影响线粒体复合物Ⅰ组装，从而影响籽粒发育的EMP10、PPR14和Dek37等[4,72-73]；通过影响核糖体蛋白3(rps3)的成熟和翻译来影响籽粒发育的MPPR6等[74]。此外，Dek2通过特异性地参与线粒体nad1内含子1的剪接，影响线粒体的氧化磷酸化和籽粒的发育[10]；PPR78的功能缺失能够影响nad5的成熟和mRNA的稳定，阻碍呼吸链复合物Ⅰ的组装，进而影响籽粒的发育[75]。由此可知，PPR基因家族在玉米籽粒发育过程中扮演了非常重要的角色。有趣的是，通过在一个最近释放的蛋白互作数据库(http://minteractome.ncpgr.cn/)[76]中搜索，该PPR蛋白可能与Emp32互作。Emp32编码一个靶向线粒体的P型PPR蛋白，其功能的缺失极大降低了nad7第二内含子的剪切效率，阻碍了线粒体复合物Ⅰ的组装及氧化磷酸化过程，进而影响籽粒发育[77]。因此，Zm00001d037975很可能参与Emp32对玉米籽粒发育的调控路径，但其确切的分子机制仍需进一步研究。
此外，本研究还发现了3个未报到的核糖体蛋白编码基因，它们分别编码40S核糖体蛋白S12、60S核糖体蛋白L29以及核糖体蛋白L18p/L5e。核糖体是一种高度复杂的细胞器，被称为细胞内蛋白质合成的机器。多项研究表明，核糖体蛋白参与玉米籽粒的发育过程，其功能的缺失可能导致胚乃至籽粒的败育[2,78⇓⇓-81]。Lem1(lethal embryo 1)编码质体核糖体蛋白S9(RPS9)，该基因功能缺失导致玉米胚败育，但胚乳发育正常。随后克隆的emb8515与lem1突变体具有相似的表型。EMB8515编码质体核糖体蛋白L35，是质体50S核糖体的一部分。该基因突变会导致质体中蛋白合成的缺陷，最终导致胚败育。URB2(Unhealthy Ribosome Biogenesis2)基因与核糖体合成有关，其突变体urb2的籽粒中60S/40S和80S/40S核糖体比值降低，多聚核糖体比值增加，籽粒变薄且发育迟缓。此外，编码线粒体核糖体蛋白的DEK44通过影响线粒体和核基因组中呼吸链相关基因的表达，以及周期蛋白依赖性激酶介导的活性来调控细胞生长和籽粒发育。综上所述，核糖体蛋白确实通过多种途径参与玉米籽粒的发育。
本研究通过全基因组关联分析，鉴定到18个显著的SNP位点与5个玉米籽粒相关性状关联，这些位点可解释12.24%~15.41%的表型变异。在籽粒长度性状中检测到4对SNP之间存在上位性互作，但效应较小。因此，在该群体中，玉米籽粒相关性状的遗传结构主要由加性效应贡献。通过综合考虑加性效应和上位性效应，每个性状可解释15.41%~58.71%的表型变异。在筛选到的19个候选基因中，编码PPR蛋白的Zm00001d037975基因可能与已知调控籽粒发育的Emp32基因互作，参与Emp32对玉米籽粒发育的调控路径，是一个重要的候选基因。其他基因编码不同类型的蛋白，包括酶、转录因子和核糖体蛋白等，暗示这些基因可能从不同方面调控籽粒相关性状。综上所述，本研究鉴定的重要遗传位点和候选基因可为进一步克隆籽粒发育相关基因、揭示其分子机制以及分子标记辅助育种等提供指导。

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